| 耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学 |
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| 引用本文： | 陈杰,贾旭,于慧敏,罗晖,沈忠耀.耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学[J].化工学报,2014(7). |
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| 作者姓名： | 陈杰 贾旭 于慧敏 罗晖 沈忠耀 |
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| 作者单位： | 清华大学化学工程系生物化工研究所;北京科技大学生物科学与技术系; |
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| 基金项目： | 国家重点基础研究发展计划项目(2013CB733600);国家自然科学基金项目(20976094)~~ |
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| 摘 要： | 双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHaseM-TH-SBM(S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436(+))进行盐桥网络分析,发现其全局盐桥总数有所下降,但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHaseM-TH(TH)、盐桥突变酶NHaseM-TH-SB(SB)和盐桥耦合定点突变的重组酶NHaseM-TH-SBM(SBM),研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明,SBM的腈水合酶活性为543.9 U·mg?1,比TH提高了31.0%;其米氏方程催化速率常数Kcat比TH提高了20%。SBM的表观失活常数KD在25~42℃范围内均明显低于对照TH,在42℃时为TH的68.0%,显示了良好的热稳定性。SBM是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。
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| 关 键 词： | 腈水合酶 末端盐桥 定点突变 反应动力学 米氏方程 失活动力学 |
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