Vero细胞对狂犬病病毒aGV株的易感性

目的探讨WHO引进的Vero细胞对狂犬病病毒(rabies virus,RV)aGV株的易感性。方法将RV aGV按MOI 0.01~0.1感染Vero细胞主代和工作代,显微镜下观察细胞形态;免疫荧光法观察感染24、48、72和96 h细胞内病毒的增殖情况;连续培养15 d,每天取上清液,采用免疫荧光法检测病毒滴度。结果 RV感染Vero细胞可致细胞圆缩病变,病毒感染第7天,病变率约为20%;RV感染Vero细胞主代和工作代24 h单个细胞内可见特异性荧光灶,48 h 20%~30%细胞内可见荧光灶,72 h 60%~80%细胞内可见荧光灶,96 h 90%~100%细胞内可见荧光灶;病毒感染后2~8 d,上清液中检测到的RV滴度均在103~108 FFU/ml之间波动,均为第8天达到高峰,达5.0×108FFU/ml以上。结论 WHO引进的Vero细胞对RV aGV株有较强的易感性,可应用于狂犬病疫苗的规模化生产。     

带状疱疹疫苗生产中2BS细胞细胞工厂培养工艺的建立

目的建立带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺。方法将2BS细胞复苏(28代)后,连续传代至35、36代,再分别按1∶4、1∶2比例传至10层细胞工厂中,采用不同的加液量(200、300、400 ml/层)进行培养,显微镜下观察细胞形态,并进行细胞计数。取细胞工厂,按MOI 0.008接种水痘-带状疱疹病毒,制备成带状疱疹减毒活疫苗,检测疫苗原液及成品的滴度;疫苗成品进行37℃稳定性试验;采用酶联免疫法检测抗生素残留量和牛血清白蛋白残留量;凝胶法检测内毒素含量;水分容量滴定法检测水分含量。结果 2BS细胞按1∶2比例传代,细胞工厂单层加液量为300 ml,可制备单层致密、优质的细胞,细胞工厂收获时细胞病变达80%以上,且病变细胞圆润、典型、广泛,细胞形态保持较好;传代比例为1∶4的细胞制备的疫苗原液及成品的滴度明显低于传代比例为1∶2的细胞制备的疫苗,且1∶4传代的细胞制备的疫苗成品37℃稳定性滴度不符合带状疱疹疫苗放置1周病毒滴度不小于4.6 lg PFU/ml的质量标准;其他各项质量指标均符合要求。结论建立了带状疱疹疫苗生产中2BS细胞在细胞工厂中的培养工艺,利用细胞工厂可制备出质量均一、致密优质的2BS细胞。     

冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种的筛选

目的筛选冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种。方法将原代地鼠肾细胞传毒种(北京固定毒7aG)和豚鼠脑传毒种(北京固定毒6aG4)平行接种于10层细胞工厂培养的原代单层地鼠肾细胞,收获病毒液,共收获8次,1、3、5、7、9号细胞工厂接种脑毒,2、4、6、8、10号细胞工厂接种细胞毒。1次收获(简称1收)培养72h,从2次收获(简称2收)开始,培养24h,收获液经超滤浓缩、柱层析纯化、除菌过滤、再浓缩配制成人用狂犬病疫苗半成品,检测各项指标,筛选最佳毒种。结果6aG4株毒种制备的病毒收获液、浓缩液、纯化液、纯化除菌过滤液、狂犬病疫苗半成品的各项检定指标都优于7aG毒种。结论豚鼠脑传毒种(6aG4)明显优于原代地鼠肾细胞传毒种(7aG),选择豚鼠脑传毒种(6aG4)作为人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产毒种。     

鸡胚细胞制备17D黄热疫苗

目的应用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗。方法细胞与病毒同时接种,选择病毒增殖的适宜条件,收获病毒液,加入稳定剂,制备成冻干鸡胚细胞黄热疫苗,并进行鉴别试验、病毒滴定和疫苗保护力试验。结果病毒增殖的最适MOI为0.00046PFU/cell;最适培养温度为37℃;第2天洗换,第4天收获更合适;最适病毒感染细胞数为6.80×105～7.00×105个/ml。病毒感染鸡胚细胞后,滴度可达6.15～6.97LgPFU/ml。疫苗主要指标均达到《中国生物制品规程》(2000版)和WHO对疫苗的要求。免疫小鼠45d后,用卵黄囊疫苗4×103PFU脑内攻击,小鼠全部存活。结论在适宜的条件下,用鸡胚细胞制备17D黄热疫苗,能达到WHO疫苗人用标准。鸡胚细胞有取代鸡胚卵黄囊制备黄热疫苗的可能。     

miR-34a慢病毒表达质粒的构建及其对人结肠癌SW480细胞增殖的作用

目的构建miR-34a慢病毒表达质粒,并检测其对人结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法以hsa-miR-34a前体序列pre-miR-34a为模板,设计末端部分互补的引物,进行引物退火反应,形成引物二聚体,进行PCR扩增,再以此DNA双链为模板进行PCR扩增,PCR产物酶切后,插入线性化的慢病毒载体pGIPZ-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒pGIPZ-miR-34a,与包装质粒Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒的包装,梯度稀释法检测重组慢病毒的滴度。将包装好的重组慢病毒感染SW480细胞,qPCR法检测感染细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平;MTT和平板克隆法检测感染细胞的增殖活力;流式细胞术检测感染细胞的细胞周期分布。结果 PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确;重组慢病毒的滴度为6.52×108TU/ml;重组慢病毒感染SW480细胞后,显著上调了细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平,明显抑制了细胞的增殖活力(P<0.01),G0-G1期细胞比例明显增加(P<0.01)。结论成功构建了miR-34a慢病毒表达质粒,慢病毒感染SW480细胞后,能显著提高miR-34a的内源性表达,并抑制细胞的增殖,为进一步研究miR-34a的功能及作用机制奠定了基础。     

3株我国狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的培养及生长特性

目的比较3株来自我国不同地区的狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的生长特性,为建立狂犬病病毒感染模型奠定基础。方法分别通过乳鼠脑内接种和细胞培养法进行连续传代,测定不同代次SXYQ、YN01和GDMMD57株狂犬病病毒街毒株的病毒滴度,计算半数细胞感染量(TCID50)。结果 SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒乳鼠脑内接种传代至10代,病毒滴度随传代次数的增加,呈上升趋势,至第8代后,病毒滴度趋于稳定,分别为105.85、105.63和105.97 TCID50/g,不同毒株间病毒滴度存在差异。SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒接种N2a细胞后,随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性不断增强,病毒滴度呈上升趋势,至第15代后,病毒滴度趋于稳定,不同毒株间病毒滴度存在差异;第20代SXYQ株病毒的滴度在感染后2.5 d达到峰值(106.80 TCID50/ml),YN01和GDMMD57株病毒滴度在感染后3 d达到峰值(均为107.30 TCID50/ml)。结论 3株病毒在细胞和乳鼠脑内经连续传代后均能达到较高滴度,可用于狂犬病病毒感染模型的建立及新型疫苗的研究。     

人巨细胞病毒ISCOMs对小鼠细胞免疫应答的调节作用

应用人巨细胞病毒被膜蛋白制备实验型免疫刺激复活物 (ISCOMs)疫苗能诱发细胞免疫反应。对小鼠 1次接种ISCOMs未能诱生明显细胞毒性T细胞 (Tc)及自然杀伤细胞 (NK)细胞活性增加 ,但能使L3T4及其与LyT2的比值增加。第 2次免疫后小鼠Tc及NK细胞活性明显增加。提示该疫苗有可能在预防人巨细胞病毒 (HC MV)原发感染中发挥作用。     

水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)制备方法的改进

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(Oka株)的制备方法,提高毒种的病毒滴度及稳定性,延长保存时限。方法分别采用原法(病毒吸附感染法)和改进的方法(病毒混合感染法)制备水痘-带状疱疹病毒Oka株工作种子批,采用蚀斑法检测病毒滴度及-70℃保存0、1、6、12个月的稳定性,并各制备出3批疫苗进行全面检定。结果采用病毒混合感染法和病毒吸附感染法制备的毒种病毒滴度分别为6.6和6.5 lgPFU/ml,病毒混合感染法制备的毒种在-70℃以下保存12个月,病毒滴度无明显下降;病毒吸附感染法制备的毒种-70℃以下保存6个月,病毒滴度下降明显。两中方法制备的水痘减毒活疫苗成品的各项检定结果均符合要求,病毒滴度及37℃稳定性无明显差异。结论采用病毒混合感染法制备的毒种提高了病毒滴度和-70℃保存的稳定性。     

多层细胞工厂在水痘-带状疱疹减毒毒种(OKa株)传代中的应用

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(OKa株)培养方法,提高毒种的均一性及稳定性,延长保存时间。方法分别采用原培养方式(2 L方瓶培养法)和改进的培养方式(40层细胞工厂)制备水痘-带状疱疹病毒OKa株工作种子批,检测病毒滴度及-65℃以下保存1、3、6、12个月的稳定性,并用该种子批分别制备3批水痘减毒活疫苗后,进行疫苗成品的全面检定。结果 2 L方瓶培养法和40层细胞工厂制备的水痘-带状疱疹病毒工作种子批OKa-2015[1]C和OKa-2015[2]C的病毒滴度分别为6.1和6.0 lg PFU/ml;无菌试验、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求;-65℃以下保存12个月,滴度均无明显下降。两种培养方式各制备的3批疫苗成品的各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,各批疫苗的病毒滴度及37℃热稳定性差别不明显。结论 40层细胞工厂制备水痘-带状疱疹病毒毒种(OKa株),-65℃以下长期保存具有稳定性,该培养方式可提高毒种的均一性,降低微生物污染风险。     

森林脑炎病毒滴度检测蚀斑法的建立及验证

目的 建立原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞适应的森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)株(简称PHKT株)感染性滴度检测的蚀斑法，并对建立的方法进行验证。方法 将主代鼠脑适应株TBEV感染原代地鼠肾PHK细胞，连续传12代。分别采用蚀斑法(将不同代次PHKT以不同稀释倍数感染单层BHK-21细胞，中性红染色，计算蚀斑数)和小鼠脑内攻毒滴定法(将不同代次PHKT以不同稀倍数经脑腔攻击小鼠，0.03 mL/只，连续观察14 d,Reed-Muench方法计算半数致死量)检测PHKT滴度，并对两种方法检测结果的相关性进行分析。对建立的检测TBEV滴度的蚀斑法进行专属性、重复性和中间精密度验证。结果 PHKT病毒蚀斑滴度最高达8.9 lgPFU/mL；蚀斑法与小鼠脑内攻毒滴定法检测结果相关性较好(r=0.92)；蚀斑法检测PHKT病毒感染性滴度专属性良好，重复性和中间精密度变异系数(CV)均<5%。结论 建立了检测PHKT感染性滴度的蚀斑法，可作为小鼠脑内攻毒滴定法的替代方法。     

生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1的基因分析

目的分析生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1基因变异对病毒特性的影响。方法比较2005～2008年间上海生物制品研究所流感病毒H3N2型各疫苗株的生产数据,并对H3N2型各疫苗株的HA1基因序列数据进行分析。结果各疫苗株中,A/NewYork/55/2004(NYMCX-157)的血凝素得率最高,A/Brisbane/10/2007(IVR-147)最低;2006～2007年度疫苗候选株A/Wisconsin/67/2005(NYMCX-161B)的病毒复制能力优于A/Hiroshima/52/2005(IVR-142);各疫苗株的氨基酸差异均未直接涉及到HA1蛋白二硫键组成位点,直接涉及到HA1蛋白抗原决定簇位点、HA1蛋白糖基化位点和HA蛋白受体结合位点的变异分别有3处(140、156和193位)、1处(165位)和1处(225位)。结论2005～2008年间各流感病毒疫苗株血凝素得率因株而异,HA1蛋白抗原决定簇位点变异属于正常的不同毒株间的差异;糖基化位点、二硫键组成位点和受体结合位点基本保守;还需进一步研究部分位点氨基酸变异是否与病毒复制能力密切相关,并探讨改善复制能力的可能性。     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

三七皂苷R1对铝佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用

目的探索三七皂苷R1对Al(OH)3佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用及降低铝佐剂用量的可行性。方法在甲型肝炎病毒(HAV)抗原中,加入不同剂量的铝佐剂与三七皂苷R1构成复合佐剂,经肌肉注射免疫小鼠,每隔4周检测小鼠血清HAV-IgG水平,并与无佐剂组和单独铝佐剂组进行比较。结果各免疫组抗体水平在12周时达到最高,之后逐渐下降。在抗原中加入复合佐剂后,与无佐剂组相比,IgG水平显著升高;与单独铝佐剂组相比,加入一定剂量的三七皂苷R1能够显著增强铝佐剂的作用,且抗体水平维持时间较长。结论适当剂量的铝佐剂与三七皂苷R1混合作为佐剂,具有增强铝佐剂的作用,并能降低铝佐剂的用量。     

甲型肝炎病毒(L-A-1株)基因型分析

目的 分析甲肝病毒基因型,为确定我国甲肝的分子流行病学及疫苗的安全性和免疫原性奠定基础。方法 采用抗原捕获聚合酶链反应（AC/PCR）,依据国际上甲肝病毒分型标准,扩增VP1/2A结合处的168个核苦酸（nt2909～3264）。结果 经生物信息学软件分析,得出L-A-1株病毒属于甲肝病毒基因IB亚型。结论 在我国有IA和IB两个亚型甲肝病毒流行。     

采用一批细胞基质同时收获甲肝和麻疹病毒

目的 采用一批细胞基质同时收获甲肝和麻疹病毒。方法 应用甲肝 L-A-1株和麻疹 27D3株,间隔3周先后感染同一批人胚肺二倍体细胞2BS株,待两种病毒同时达到增殖高峰期时收获病毒液（以下简称HAM）,并分别进行病毒滴定、特异性检查、猴体安全性和免疫效果试验。结果HAM的甲肝和麻疹病毒滴度与同批单价甲肝和麻疹疫苗病毒滴度,差异均无显著意义。结论 该方法用于制备甲肝-麻疹联合疫苗,操作简便,省时省力,并可显著降低疫苗生产成本。     

甲型肝炎灭活疫苗免疫原性的猴体实验

甲型肝炎病毒TZ84毒株经 2BS二倍体细胞培养制备成甲型肝炎灭活疫苗。采用普通狨猴和恒河猴进行疫苗的保护性研究。结果均有较好的抗体反应 ,而且对甲型肝炎病毒鲁兴株 (强毒株 )的攻击亦均有保护作用。表明该疫苗有较好的免疫效果。     

不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果

目的评价不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果。方法培养并纯化流感病毒鼠肺适应株PR/8/34,制备流感病毒裂解液。将BALB/c小鼠随机分为5组:流感病毒PR/8/34裂解液(HA)组、HA+大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(Heat-labile exterotoxin B subunit,LTB)组、HA+弗氏不完全佐剂(FIA)组、HA+A(lOH)3组和生理盐水对照组,HA+LTB组采用滴鼻黏膜免疫,免疫剂量为50μl/只,其余各组均采用肌肉注射,免疫剂量为100μl/只,共免疫2次,间隔2周。于初次免疫后28 d,经小鼠眼内眦采血,分离血清,检测各组小鼠血清IgG抗体效价、血凝抑制效价及攻毒后保护力及鼠肺病毒RNA载量,评价不同佐剂对流感疫苗的免疫增强作用。结果各佐剂组小鼠血清IgG抗体水平及血凝抑制效价均显著高于HA组,且差异均有统计学意义(P均<0.01);HA+FIA组小鼠血清IgG抗体水平及血凝抑制效价均显著高于HA+LTB组和HA+A(lOH)3组(P均<0.01);HA+LTB组与HA+A(l OH)3组抗体效价差异无统计学意义(P>0.05)。各佐剂组和HA组小鼠攻毒后均存活,HA+FIA组鼠肺病毒RNA载量最低,HA+LTB组与HA+A(lOH)3组相当。结论不同佐剂对流感疫苗均有一定的免疫增强作用,其中LTB滴鼻免疫和A(lOH)3肌肉注射对流感疫苗的免疫增强作用相当。     

禽流感病毒抗原-抗体复合物的制备及其免疫原性

目的制备禽流感病毒抗原-抗体复合物,并检测其免疫原性。方法以H5亚型禽流感病毒的HA蛋白为抗原,其病毒的高免卵黄为抗体,将抗原与抗体按不同比例混合,制备禽流感病毒抗原抗体复合物。免疫1日龄SPF仔鸡,进行保护力试验;于免疫后不同时间检测血清HI抗体水平,并与H5亚型油乳剂灭活疫苗进行比较。结果抗原与抗体比例为1∶0.6的抗原-抗体复合物在免疫仔鸡15d后,其诱导的平均抗体水平达6.5log2,与H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗(6.2log2)相比,差异无统计学意义;在等量病毒攻击后,二者对仔鸡的保护率相同(93.3%)。结论制备的禽流感病毒抗原-抗体复合物具有良好的免疫原性,为研制禽流感新型复合物疫苗提供了依据。     

甲型肝炎减毒活疫苗冻干保护剂的研究

目的 研究冻干甲型肝炎减毒活疫苗的保护剂。方法 甲型肝炎病毒L-A-l株经2BX二倍体细胞培养,制备成甲型肝炎减毒活疫苗,再添加不同保护剂进行冷冻干燥。结果 以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐等为主的保护剂,对甲型肝炎减毒活苗病毒显示了较好的保护性,疫苗冻干前后感染滴度下降在1.0Log CCID50/ml以内,符合《中国生物制品规程》要求。结论 以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐等为主的保护剂是一种安全性较高、疫苗冻干效果较好,适合于疫苗规模化生产的保护剂。     

甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达

目的构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。方法将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因。经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA。脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达。结果扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达。结论已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA。