抗人CD25人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的稳定表达及初步鉴定

目的在CHO细胞中稳定表达抗人CD25人鼠嵌合抗体,并对抗体活性进行初步鉴定。方法采用脂质体法将嵌合抗体真核表达质粒pOptiVEC-H和pcDNA3.3-L共转染CHO-DHFR-细胞,通过去除HT和在培养基中加入500μg/ml的Geneticine进行阳性克隆的筛选,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆,通过在培养基中加入浓度逐步增加的MTX提高克隆的抗体表达量。采用流式细胞术(FCM)检测嵌合抗体的抗原结合活性及人抗体重链Fc段、轻链κ链;提取细胞基因组进行PCR鉴定;抗体经超滤浓缩后,采用蛋白G亲和纯化法进行纯化,并进行Westernblot分析;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,采用ELISA法检测抗体分泌的稳定性。结果获得稳定分泌嵌合抗体的细胞株1C1,ELISA检测抗体表达量为103ng/ml;PCR结果表明,表达的质粒已整合入细胞基因组中;FCM及Westernblot结果显示,嵌合抗体含有人抗体重链Fc段及轻链κ链,且保留了鼠抗体V区的抗原结合特异性;经蛋白G亲和纯化后,获得抗体220μg,纯度>97%;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,抗体分泌保持稳定。结论获得了稳定表达人CD25人鼠嵌合抗体的CHO细胞株,其具有鼠源抗体的抗原结合特异性及人抗体的恒定区。     

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达

目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。     

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。     

人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性。结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性。结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达。     

利用单个B细胞制备人源SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体

目的 利用单个B细胞制备人源严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)单克隆抗体，并检测其中和活性。方法 采集经2次SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)免疫，且抗体水平较高的人静脉血，用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，经偶联S蛋白的磁珠分选表达S蛋白抗体的单个B细胞。将单个B细胞反转录后，用套式PCR法扩增IgG重链、轻链可变区基因；通过重叠PCR法将可变区基因与CMV启动子及IgG leader序列DNA片段、IgG恒定区及PolyA序列DNA片段连接，构建抗体线性表达盒。将同一B细胞的重链、轻链线性表达盒转染HEK293T细胞，表达人源SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫荧光法检测抗体免疫反应活性，假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果 共表达了26株SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体，经Western blot检测，于相对分子质量约55 000和25 ...     

人MCIR基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MCIR基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MCIR为模板，利用PCR方法扩增人MCIR基因，将MCIR基因连接到pfastBacl质粒上，与穿梭载体DH10Bac转座，获得Bacmid-MCIR质粒后，通过脂质体介导，转染Sf9细胞，使其表达重组杆状病毒，经SDS-PAGE检测表达产物，放射受体分析法检测目的蛋白MCIR活性。结果Bacmid-MCIR质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱，在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和，具有生物学活性。结论MCIR基因成功在真核细胞中得到表达。     

抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达

目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。