福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究

本研究尝试采用国际上新兴的青枯菌演化型分类框架并结合传统的生化变种鉴定方法,旨在探究福建省烟草青枯病菌系的构成,从而揭示青枯病的流行规律,为指导烟草青枯病的抗病育种提供理论依据。2008~2009年,分别于福建省南平、三明以及龙岩地区田间烟草病株上分离获得了45个烟草青枯病菌株。经青枯菌演化型复合PCR检测,45个菌株均能够扩增得到片段大小分别为144 bp和280 bp的两条特异性扩增条带,从而表明全部分离菌株均系青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株。继而基于45个分离菌株对3种双糖和3种己醇氧化利用能力的检测结果,鉴定出其中43个菌株属于青枯菌生化变种III,1个菌株属于生化变种IV,1个菌株属于非标准型生化变种（能利用山梨醇和甜醇,不能利用3种双糖和甘露醇）。该研究结果部分揭示了造成国外引进的烟草品种青枯病抗性水平下降或丧失的可能原因。      

湖北恩施烟区烟草青枯菌致病力分析

为有效进行恩施烟区烟草青枯病的防控,本研究采用人工接种的方法鉴定了恩施烟区烟草青枯菌的致病性。根据红花大金元、K326和岩烟97三个烟草品种病害流行下曲线面积(AUDPC)数值进行聚类分析,将恩施地区烟草青枯菌划分为强、中、弱3种致病型,表明恩施烟草青枯菌是一个由弱到强连续变化的群体。3种致病型菌株在恩施南部和北部区域均有分布,其中恩施北部区域菌株致病力稍高于南部。     

湖北地区烟草青枯菌系统发育分析

本研究采用青枯菌演化型分类框架,对来源于湖北烟区的48个烟草青枯菌进行系统发育学分析并进行序列变种鉴定,以明确该地区烟草青枯菌的菌系分化。基于青枯菌内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA蛋白修复基因(mutS)的系统发育学分析结果表明,48个供试菌株属于青枯菌亚洲分支(演化型Ⅰ)的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,未发现我国已报道的烟草青枯菌序列变种34。其中序列变种17和44为优势菌系,且均来源于恩施地区;序列变种15只包含来源于十堰地区的3个菌株。本研究表明湖北地区烟草上的青枯菌存在一定程度的遗传分化。     

重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究

为进一步明确重庆烟区烟草青枯菌的遗传及生化特性,采用生化变种分类标准及演化型复合PCR、系统发育进化分析对重庆10个烟草青枯病发生区县青枯雷尔氏菌的种下分化情况进行了研究。结果表明:46株烟草青枯雷尔氏菌均属于生化变种3和亚洲分支菌株(演化型Ⅰ)。内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA修复蛋白基因(mutS)部分序列的系统发育学分析表明:46株供试菌株可聚类到青枯雷尔氏菌演化型Ⅰ的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,其中序列变种17和44为优势菌株。表明重庆烟草青枯雷尔氏菌具有一定的遗传分化和地理区域特性。     

豫南烟区烟草青枯病危害调查及病原鉴定

2014年从豫南烟区信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土,分离纯化出菌株26个,测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上,对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,表现出典型的青枯病症状,发病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落,证实病原为烟草青枯病病原。由此表明,豫南烟区确有烟草青枯病的发生。     

烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定

为了获得防治烟草青枯病新途径,从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的健株上,共分离到内生菌株160个。经对峙培养法测定,32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用,其中H-1、H-9和H-11有强拮抗作用,抑菌圈分别为3.0、3.0、4.5 mm。根据其形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生菌H-1为枯草芽孢杆菌,H-9和H-11为短芽孢杆菌。     

重庆地区烟草青枯病菌的生物型测定

从重庆市黔江区、酉阳县、武隆县烟田采集的烟草青枯病典型病株中,分离获得了44个菌株,进行了鞭毛染色和致病性测定,并进一步研究了菌株对双糖和己醇的利用能力以及对硝酸盐的还原作用、产气情况。结果显示:44个菌株的菌体形态均与青枯病菌菌体形态一致,且均具有致病性;这些菌株均属于生物型Ⅲ,无亚型及其它生物型。     

重庆地区烟草青枯病菌生理小种的初步鉴定

从重庆市黔江区、酉阳县、武隆县烟田采集的烟草青枯病典型病株中,分离获得44个致病的青枯病菌株,并进行了生理小种的初步鉴定.根据在生理小种鉴另q寄主上的反应和烟叶浸润反应、黑色素产生试验,将44个菌株初步划为1号生理小种,其中35个菌株对所有鉴别寄主表现出高度致病性,在6个鉴别寄主上平均病情指数在90以上的菌株有10株,它们分布在黔江区水田乡、新华乡和武隆县黄莺乡、仙女山镇.     

湖北省烟草黑胫病菌生理小种研究初报

在湖北省襄樊、恩施等主要烟区采集烟草黑胫病病株样本111个,分离纯化出30个烟草黑胫病菌株。采用游动孢子悬浮液注射接种鉴别寄主和TTZ(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)颜色反应两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明,供试的30个菌株在TTZ培养基中的反应皆为红色,有24个菌株在鉴别寄主反应中对L8和NC1071有较强致病力,而对N.nesophila无致病力,应为1号生理小种,占供试菌系的80%,为湖北省优势生理小种;其他6个菌株中有4个菌株对NC1071有较强致病力,但对L8致病力较弱,有1个菌株对L8和NC1071致病力较弱;1个菌株对NC1071致病力较弱,但对L8有较强致病力;6个菌株对N.nesophila无致病力,是否为2号生理小种还是其他致病型,尚待进一步研究确定。     

五个烟草野火菌株的生理小种鉴定

  背景和目的  针对目前国内尚未以国际通行的抗性鉴别宿主区分烟草野火菌的生理小种, 首次基于抗性遗传规律鉴定了所收集野火菌株的生理小种归属。  方法  通过大田喷雾接种、温室浓度梯度接种、无损伤接种及同一叶片上的对比试验等4个平行试验, 将ATCC11528等5个野火菌株接种到黄花烟等6个不同抗源遗传背景的烟草上, 根据不同试验出现的不同病理反应对各野火菌株进行生理小种分类。  结果  所收集的5个野火菌株经多轮分子标签鉴定纯化, 可用于接种试验。野火菌株D151、ZD和M109、ATCC11528和W11分别被鉴定为0、1、3等3个小种。  结论  采用国际通行的抗性鉴别宿主和4个平行接种试验区分了5个野火菌株的生理小种归属。为培育野火菌小种专化抗病烟草和克隆烟草中小种专化抗病基因提供了重要基础。      

豫南烟区烟草青枯病菌的致病力及遗传多样性分析

为有效防控豫南烟区烟草青枯病,对来自信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县的烟草青枯病菌的致病力和遗传多样性进行了测定分析。人工接种试验表明,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力分为强、中和弱3种,不同寄主来源的烟草青枯病菌具有显著的致病力差异。从100个随机引物中筛选出8个扩增条带清晰且具有丰富多态性的引物用于不同地区烟草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析,共扩增出720条带,其中多态性带占88.9%。聚类结果和遗传相似系数分析显示,供试菌株可分为A、B两大类,遗传相似系数范围为0.49~1.00,且供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。综上所述,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力存在明显差异且其DNA具有丰富的遗传多样性。     

白肋烟栽培土壤中青枯病菌的鉴定与生化型分析

为建立一套成本低廉、简单快速的分离检测土壤青枯病菌的方法,采用半选择性培养基(PCCG)和PCR技术相结合,从白肋烟栽培土壤中分离鉴定出12个菌株,并分析了这12个菌株的ITS序列 .结果表明:分离出的12个菌株ITS序列与青枯病菌同源性最高,达到92.6％,该方法适合于土壤中青枯病菌的分离鉴定.Hayward的青枯病菌生化型鉴定结果表明,这12个菌株均为生化型Ⅲ.     

烟草青枯病拮抗菌的筛选及抑菌活性的测定

为有效防治烟草青枯病,从贵州省青枯病迟发烟地和不发烟地土壤中筛选出15株拮抗菌,对拮抗菌的拮抗能力进行了鉴定。筛选出拮抗力较强的3个菌株(LCA-9、PCM-4、SXM-2),并对3菌株的抗菌物质进行了粗提,检验其抑菌活性。结果表明:3种菌的发酵分泌液对烟草青枯病均有一定的抑制作用,其中SXM-2发酵液的抑菌活性较大、效果较好。     

皖南烟田三种土传病原物分子检测

为检测皖南烟田土传病害的分布,2011-2012年从皖南烟区烟田共采集土样51份,采用分子生物学方法对烟田土壤进行了烟草黑胫病、根黑腐病和青枯病检测。结果显示,烟田土壤中烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和青枯病菌的阳性率分别为19.6%、41.2%和56.9%,3种烟草土传病原菌在皖南烟区多数烟田均有分布,其中青枯病菌检出率最高。本研究证明了应用分子生物学方法检测土传病原菌的可能性,生产上可为烟草种植提供理论依据。     

生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用

  目的  探究不同用量的生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用  方法  采用稀释平板法,研究生物炭对青枯菌的吸附作用及对其生长和运动性的影响;盆栽试验研究生物炭对烟草生长及青枯病发病情况和土壤基本理化性质的影响;利用高通量测序技术,比较各处理土壤细菌群落差异。  结果  （1）生物炭对青枯菌具有抑制作用,可吸附青枯菌、抑制其生长及运动性,用量超过1.5%时效果显著;（2）生物炭提高了土壤pH、有机质、速效磷和速效钾含量,利于烟草的生长。相关性分析发现,生物炭对土壤pH和化学性质的改善,是抑制烟草青枯病发生的主要原因;（3）生物炭提高了根际土壤微生物群落的Alpha多样性和放线菌门中链霉菌属的相对丰度;（4）根际土壤细菌结构的多样性与土壤理化性质有一定的相关性,其中有效钾影响最大。  结论  生物炭通过对青枯菌的抑制作用和对土壤微生态的改善,创造了利于烟草生长的环境条件,减少了烟草青枯病的发生。      

无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

为进一步揭示无致病力菌株对烟草青枯病的控病机理,以无致病力青枯菌株为材料,针对烟草青枯病进行了温室控病及田间小区试验,并通过抗药性标记测定其抗药性突变菌株在烟株体内的定殖状况,同时分析处理后烟株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果显示:无致病力菌株Tbw1-7-3在温室盆栽条件下对青枯病的相对防效达89.4%,其田间防效在发病初期10~20 d与药剂农用链霉素处理间无明显差异,且其抗药性突变株在烟株根表和体内可短暂定殖。同时菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3种酶活性及促进病程相关蛋白(PRP)的积累。无致病力菌株对烟草青枯病具有较好的控制作用,以菌株Tbw1-7-3的防效最优。田间试验也显示Tbw1-7-3菌株在发病初期具有良好的控病效果。无致病力青枯菌株的控病机理可能兼有占位效应及诱导抗病性。