rBS-WC霍乱疫苗的动物免疫研究

rBS与WC联合免疫比单纯免疫效果好；小鼠或家兔的免疫间隔适当缩短未见影响免疫保护力；小鼠一次大剂量口服疫苗后可获良好保护。rBS－WC抗原、吸附霍乱类毒素疫苗（上海苗）和吸附霍乱疫苗（武汉苗）经家兔肌肉免疫，武汉苗未见抗CT反应，对CT攻击无保护，对Eltor（小川）活菌攻击保护较弱，上海苗抗CT反应比rBS－WC低。家兔口服rBS－WC半年后，抗CT及杀弧菌抗体维持较高水平，显示其动物免疫的持久性。     

霍乱弧菌细胞壁抗原菌苗的研究

霍乱弧菌经过 SephadexG-200凝胶柱层析提纯得到2个细胞壁抗原,称为Ⅰ抗原和Ⅱ抗原,分子量分别为110,000 Dal 和60,000Dal。Ⅰ抗原为脂多糖成份;Ⅱ抗原主要为蛋白成份。二者无论经口服或非肠遭途径免疫家免或小鼠都能产生特异性抗体,即其免疫血清在琼脂双扩散试验中有特异性抗原抗体沉淀线形成,杀弧菌抗体和凝集抗体的水平升高,并可使免疫动物耐受一定量霍乱弧菌或霍乱毒素的攻击。当Ⅰ、Ⅱ两抗原混台(称为Ⅰ+Ⅱ抗原),产生的免疫反应较单一种抗原更强。若将Ⅰ+Ⅱ抗原再加入霍乱毒素 B 亚单位,或加热毒素或灭活的霍乱弧菌菌体,免疫家兔或小鼠后,则三者产生的免疫反应也不相同,即在小鼠肠结扎试验中耐受肠毒素攻击的反应性不同,以Ⅰ+Ⅱ抗原加菌体保护效果最好。本研究还用免疫缺陷型裸鼠证明Ⅰ、Ⅱ抗原在体内主要依赖 B 淋巴细胞引起免疫应答,而霍乱毒素主要依赖 T 淋巴细胞引起免疫应答,这是两种不同免疫反应性抗原。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1和5型交叉免疫保护研究

目的探讨猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)不同血清型间交叉免疫保护的关系。方法以1型和5型APP参考菌株为实验对象,分别测定半数致死量(LD50),制备灭活细菌抗原和活菌抗原,免疫昆明小鼠,检测ELISA抗体水平及交叉免疫反应,并分别以10LD501型和5型APP菌进行攻击,观察小鼠保护力。结果1型和5型APP菌对小鼠的半数致死量分别为8.0×105.3和5.1×103.83CFU/LD50,死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均可产生高滴度抗体,且1型与5型间存在较强的交叉免疫反应。死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均能对本型APP菌攻击产生保护,保护率在80%以上。1型活菌免疫小鼠对5型菌攻击保护率为70%,5型活菌免疫小鼠对1型菌攻击保护率为90%,1型、5型死菌免疫小鼠对5型、1型菌交叉攻击均无保护作用。结论1型、5型APP活菌和死菌免疫小鼠均可对本型菌攻击产生保护,两型间存在较强的交叉免疫反应,但只有活菌免疫可以产生较好的交叉免疫保护,死菌免疫不能产生交叉免疫保护。     

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性。方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性。结果抗原免疫母鸡10d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1∶102400,IgY抗体滴度在室温可保持5~6个月不变。结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好。     

黏膜佐剂mLT63及CpG-ODN鼻内免疫的佐剂作用

目的研究大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63和CpG-ODN鼻内免疫对抗原的佐剂效应。方法选用破伤风类毒素(TT)和小牛血清白蛋白(BSA)为抗原,mLT63和CpG-ODN为佐剂,经鼻内免疫BALB/c小鼠。ELISA间接法检测免疫小鼠血清和肺、直肠及阴道组织萃取液的特异性抗TT、BSA的IgA、IgG水平。结果mLT63和CpG-ODN均能协助TT和BSA抗原在血清、肺、阴道、直肠组织中诱导出高滴度的IgG抗体。在血清中IgA抗体滴度均比较低,而TT-IgA在肺和阴道组织中滴度较高,BSA-IgA在肺组织中滴度较高。各佐剂组之间IgG和IgA抗体水平相比,差异均无显著意义。不同剂量的mLT63诱导的BSA-IgA抗体水平差异无显著意义。结论mLT63和CpG-ODN经鼻内免疫对TT和BSA抗原均有良好的佐剂作用。     

霍乱弧菌外膜蛋白抗原的共同性和特异性

通过免疫吸收试验证明,不同生物型和血清型的霍乱弧菌外膜蛋白(OMP)是共同抗原,它们之间可互相完全吸收,共同抗原是分子量约为47K和86K的IA组分。OMP和IA组分对01霍乱弧菌是特异性抗原,其抗IA血清经LPS吸收只能与霍乱弧菌发生阳性反应,与NAG和其它革兰氏阴性菌的参试株不发生阳性反应。霍乱弧菌LPS是与革兰氏阴性菌发生交叉反应的物质,以LPS为基础制备的多价血清及其分型血清,难免发生非特异的交叉反应。     

抗脂多糖单克隆抗体细胞系的建立

细菌的脂多糖（LPS）由类脂A、核心多糖和特异性多糖三部分组成。近年来根据核心多糖相对保守的性质，国外已经制备出针对各种LPS分子中共同抗原表位的MCAb，用于临床上革兰氏阴性菌败血症患者的辅助治疗。E．C。h0111：B4菌与其它典型的革兰氏阴性致病菌一样具有血清抗性。抗Olll：B4LPS抗体通过将C3定位在细菌胞体表面，形成免疫球蛋白动。复合物，可桔抗此血清抗性，杀死细菌。我们用E．C。h0111：B4菌及其LPS（SLGMA产品）作免疫原，免疫BALB八小鼠，取其脾细胞与SPZ／0细胞在50％PEG作用下融合，于5％CO；、37C条件…     

汉坦病毒半微量直接免疫酶斑减少中和试验方法的建立及其应用

采用辣根过氧化物酶标记兔抗－HTNVIgG（HRP－抗－HTNV）染色的半微量直接免疫酶斑减少中和试验,作为检测灭活汉坦病毒疫苗和病毒中和抗体及血清学分型的方法。该方法简便、特异、敏感、稳定,结果与经典的空斑减少中和试验比较差异无显著意义（P＞0．05）,HRP－抗－HTNV可识别HTNV和SEOV的共同抗原。灭活HTNV疫苗加强免疫和部分批次初次免疫诱导较好的交叉中和抗体应答,同型与异型中和抗体滴度呈正的直线相关。     

预防O139霍乱B亚单位/全菌体口服疫苗的研究

目的 研制预防O139霍乱的B亚单位／全菌体口服疫苗。方法 应用重组霍乱毒素B亚单位及福尔马林灭活的O139霍乱弧菌全菌体,构建成B亚单位／全菌体疫苗,并进行安全性及免疫原性检测。结果 经连续3天大剂量灌喂小鼠后,未见体重下降、发病或死亡现象。全部小鼠均健康活存。以腹腔或口服免疫小鼠后,均能产生外周血或肠道局部高滴度的特异抗体。免疫小鼠对O139活菌攻击有良好的保护作用。结论B亚单位／全菌体口服疫苗在小鼠试验中安全性及免疫原性良好。     

粗糙变异型菌及其内毒素免疫小鼠抗异源G~-杆菌攻击的保护作用

采用粗糙化学型变异株明尼苏达沙门氏菌Re_(595)、大肠杆菌J_5(R_c)及其内毒素脂多糖(LPS)分别免疫小鼠,对绿脓杆菌(1863)、大肠杆菌(44141)攻击有较好的保护作用;两菌混合免疫对肺炎克雷伯氏杆菌(27736)攻击保护效果显著;LPS(J_5)免疫对变形杆菌(49005)攻击保护效果较差。免疫小鼠眼球血对小鼠抗四株异源G~-杆菌攻击亦有较好的被动保护作用。     

新型口服霍乱疫苗人体反应及效果

用工程菌产生的霍乱毒素 B 亚单位(BS)和灭活霍乱弧菌(WC)构建成新型 BSWC 口服霍乱疫苗,经志愿者口服免疫证实安全而且免疫原性良好,能刺激人体产生强的抗菌及抗毒免疫,其所引起的肠道免疫和血清抗体与用天然霍乱毒素纯化的 BS 构建成的同型疫苗效果相似,因此,可作为预防霍乱的候选苗。     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的研究

本文以简化的方法从伤寒沙门氏菌Ty2菌苗株制备外膜蛋白(Outer membraneprotein,简写为OMP),OMP的生化检测显示主要为蛋白质,并有少量LPS污染,不含有Vi多糖。由SDS-PAGE显示OMP为一组分子量介于17～70KD的蛋白质,其中分子量为36～41KD左右的蛋白带为主要蛋白带。OMP有良好的免疫原性和抗原性,不加佐剂免疫动物可产生高效价抗血清,玻片凝集试验能与不同类型抗原结构的伤寒沙门氏菌凝集,但这种凝集可因细菌Vi抗原的存在而被阻抑。动物试验表明OMP有良好的免疫原性,自动和被动免疫力试验均能对小鼠有良好的保护作用,表明OMP是一种保护性抗原。动物热原试验和体重减轻试验及毒性试验均符合有关要求。     

用无细胞百日咳抗原配制的吸附精制百白破制剂的特性和人群反应及血清学效果

用50L发酵罐培养百日咳菌,经硫酸铵盐析法提取保护性抗原,戊二醛解毒后,与白喉、破伤风类毒素及Al(OH)_3配合制成的吸附精制百白破制剂(APDT),质量符合规程要求。给3～5月龄婴幼儿接种后全身和局部副反应很低,与现行吸附百白破制剂(WPDT)有非常显著性差异。免后血清中抗-PT和抗-FHA抗体均有显著增长,与WPDT制剂组相比,APDT的抗-PT和抗-FHA抗体增长更为显著。APDT免后抗白喉、抗破伤风抗体滴度均超过保护水平。本制剂的质量及免疫效果均达到了国外同类产品水平。     

呈现人白细胞介素-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗的构建

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子与其受体结合部位潜在的B细胞表位;根据预测的人IL-13抗原肽,合成寡核苷酸序列,并经变性、退火形成双链DNA片段,插入表达乙肝核心抗原(HBcAg)的pThioHisA-HBcAg(NP)载体中,构建重组表达质粒,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)DH5α,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经硫酸铵沉淀、洗涤初步纯化,并经凝胶过滤层析、密度梯度离心、电镜观察检测其VLPs的存在;将纯化后的重组蛋白在不使用任何常规佐剂的情况下免疫昆明小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IL-13特异性抗体的滴度。结果预测分析获得了3个潜在的B细胞表位;3个重组表达质粒pThioHisA(NP)-A、B、C经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白HBcAg+A、B、C相对分子质量分别约为20 000、19 000、18 500,可被兔抗人IL-13多克隆抗体特异性识别,并以VLPs形式存在;HBcAg+A和HBcAg+B重组蛋白诱导小鼠产生了较强的抗体应答,血清中IL-13抗体滴度最高可达1∶64 000,而HBcAg+C重组蛋白未见特异抗体应答。结论成功构建了呈现人IL-13抗原表位的VLPs疫苗,该疫苗可有效打破B细胞免疫耐受,免疫小鼠后产生了高滴度的特异性抗体,为进一步在猴体哮喘模型和人类临床试验中开展IL-13疫苗主动免疫干预哮喘疾病进程的研究奠定了基础。     

阿仑膦酸钠作为口服佐剂对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响

目的评价口服阿仑膦酸钠(alendronate,ALD)对恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1免疫原性的影响。方法分别用不同剂量的ALD(0.05、0.1、1 mg)和M.RCAg-1配伍后免疫BALB/c小鼠,M.RCAg-1蛋白经背部皮下注射免疫,20μg/只,同时经灌胃给药ALD,共免疫3次,每次间隔14 d,于末次免疫后10 d经小鼠尾静脉采血,分离血清。ELISA法测定小鼠血清中抗M.RCAg-1蛋白的抗体滴度、IgG抗体分型及血清抗体对M.RCAg-1单表位的识别滴度;间接免疫荧光反应(IFA)检测小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度;ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫水平。结果 0.05 mg ALD+M.RCAg-1及0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平均可达1∶10~8;IgG抗体主要以IgG1为主;对M.RCAg-1的11个单个抗原表位(E1~E11)可全部识别;由各表位抗原(除E2外)诱导分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数明显高于分泌IFNγ的特异性淋巴细胞克隆数(P<0.0001)。0.1 mg ALD+M.RCAg-1组小鼠血清抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别滴度明显高于0.05 mg ALD+M.RCAg-1组(P<0.000 1)。结论 ALD作为恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1的佐剂可显著提高其体液免疫及细胞免疫水平。     

抗人膀胱癌抗独特型抗体诱导特异性迟发过敏反应的研究

目的研究对抗人膀胱癌抗独特型抗体(BC2)诱导的特异性迟发过敏反应(DTH)。方法经过BC2免疫的小鼠,用膀胱癌细胞系进行脚掌注射攻击后,测定脚掌水肿厚度判定DTH反应强度,并进行病理学检查。结果BC2诱导的DTH平均水肿厚度为0·95mm,与膀胱癌组织抗原组比较差异无显著意义(P>0·05);免疫鼠对胃癌细胞攻击呈阴性反应;BC2诱导的病变内可见大量炎性细胞,呈弥漫性浸润。结论BC2具有抗原模拟作用,可诱导特异性的DTH反应,可能成为膀胱癌防治的新途径。     

破伤风毒素及其片段的免疫效果

本文首次报道了破伤风毒素及其片段和片段组合对小鼠的免疫效果。通过凝胶过滤和离子交换等方法提纯了破伤风毒素及其片段。各片段中残余素素的污染率为0～0.8%。将各片段给小鼠免疫均能诱导产生保护性抗体,用破伤风毒素攻击后能使部分小鼠免于死亡。当免疫小鼠的血清抗体滴度>1∶4(0.01HAU/ml)时,小鼠在毒素攻击后一般可免于死亡,当血清抗体滴度>1∶128(0.5HAU/ml)时,则小鼠经攻毒后一般不表现出任何中毒症状,当血清抗体滴度处于二者之间时,小鼠一般表现有破伤风中毒症状,但大部分可以存活。毒素的三个片段均能诱导产生保护性抗体,但存在着明显的差别。     

狂犬病疫苗对人外周血B淋巴细胞分泌特异性抗体的体外诱导作用

目的探索在体外用狂犬病疫苗诱导人外周血B淋巴细胞(PBL)分泌特异性抗体,并使B淋巴细胞保持良好增殖和分化状态的方法。方法以狂犬病疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞进行体外诱导,并对诱导抗原量、诱导时间及IL-2、IL-6和胞壁酰二肽(MDP)等生物因素对诱导产生特异性抗体的影响进行检测,并观察PBL的活化与增殖状态。结果在特异抗原及其他生物因子的共同作用下,经免疫的人PBL体外抗原诱导5d后产生特异性抗体的量达到最大值。MDP、IL-2、IL-6对免疫志愿者的PBL体外特异性抗体的分泌有显著影响,但对未经免疫志愿者无明显影响。显微镜观察显示PBL生长与分化正常。结论已建立了体外诱导人外周血B淋巴细胞分泌特异性抗体的方法,并保持了B淋巴细胞良好的生长增殖和分化状态。     

肺炎链球菌DnaJ蛋白的原核表达及其免疫保护效果

目的原核表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)热休克蛋白40(heat shock protein 40,HSP40,DnaJ),并探讨其免疫保护效果。方法从2、3、6B、14、19F、R6型肺炎链球菌基因组DNA中扩增DnaJ基因,插入原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-DnaJ,转化大肠埃西菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组DnaJ蛋白经Ni-NTA树脂纯化后,分别经腹腔和鼻黏膜免疫小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清和唾液中特异性IgG和IgA抗体滴度;用重组蛋白刺激小鼠脾细胞,ELISA法检测细胞因子水平的变化;流式细胞术检测特异性抗DnaJ血清结合到肺炎链球菌表面的能力;检测抗DnaJ血清抑制R6型肺炎链球菌黏附A549细胞的能力。结果 6株肺炎链球菌的PCR扩增产物均可见1 119 bp的DnaJ基因片段,测序结果与GenBank中登录的序列一致;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;纯化的重组DnaJ蛋白相对分子质量约为38 000,纯度达90%以上,可与DnaJ小鼠免疫血清发生特异性反应。腹腔免疫DnaJ可使小鼠血清产生高滴度的特异性抗DnaJ抗体,鼻黏膜免疫DnaJ可增加小鼠血清和黏膜中抗DnaJ IgG和IgA抗体水平(P<0.01);鼻黏膜免疫DnaJ可使小鼠脾细胞释放高水平的细胞因子IL-10、IFNγ和IL-17A;抗DnaJ血清对肺炎链球菌具有更强的结合能力,且可抑制肺炎链球菌黏附肺癌上皮细胞A549。结论 DnaJ可诱导小鼠产生保护性免疫应答,提示其具有作为肺炎链球菌蛋白疫苗抗原的潜力。     

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用。方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价。结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少。结论PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用。