pEgr-IFNγ基因-放射治疗对荷瘤小鼠抑瘤效应的研究

探讨pEgr-IFNγ基因-放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜照射剂量和质粒注入量。观察不同剂量X射线照射及瘤内不同量pEgr-IFNγ重组质粒注入,基因-放射治疗在接种B16黑色素瘤小鼠体内抑瘤效应的差异,并用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测各组小鼠外周血IFNγ含量。结果表明,质粒注入后接受20Gy X射线照射组照后3—27d,肿瘤生长速率明显低于2Gy和10Gy照射组(p<0.001),且小鼠平均生存时间明显延长(p<0.001)。质粒注入量为20μg或30μg的联合治疗组照后3—27d,肿瘤生长速率明显低于注入量为10μg的联合治疗组(p<0.05—0.001),且平均生存时间明显延长(p<0.01)。基因-放射联合治疗组受照射后第1天和第3天外周血IFNγ含量明显高于单纯基因治疗组均为(p<0.05)和对照组,分别为(p<0.01,p<0.05)。结果显示,pEgr-IFNγ基因-放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜照射剂量为20Gy,质粒注入量为20μg;联合治疗组可能通过诱导瘤内IFNγ基因表达增强,使血液中的IFNγ浓度升高,进而增强机体免疫功能和抗肿瘤能力。     

整体照射后胸腺细胞和脾细胞p16基因转录和蛋白表达的变化

研究X射线全身照射对小鼠胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达的影响。采用Northern blot检测p16基因转录水平的变化;采用流式细胞术检测蛋白表达的变化。时程结果表明,2.0Gy照射后4-24h,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高,8-48h P16蛋白表达显著增高(p<0.05-p<0.01);照射后4-8h脾细胞p16mRNA水平明显增高,24h P16蛋白表达显著增高(p<0.05)。量效结果表明,0.5-6.0Gy照射后,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01);脾细胞p16mRNA水平亦增高,但增幅远低于胸腺细胞,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01)。X射线全身照射可诱导胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达增高。p16表达参与整体照射诱导细胞G1期阻滞的分子调控。     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和Pl6蛋白表达的变化

采用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察x射线照射对离体培养的EL-4细胞pi6基因转录及蛋白表达的影响,证实pi6基因转录表达在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中的重要作用.结果表明,2.0Gy x射线照射后2-48h,EL-4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平.P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12h P16蛋白表达非常显著高于对照组(p＜0.01).剂量-效应实验表明,0.5-6.0Gyx射线照射后12h,EL-4细胞p16mRNA水平明显提高.2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别P＜0.01).研究证实,电离辐射能够诱导EL-4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性.提示辐射诱导pi6基因转录表达增加在辐射诱导EL-4细胞G1期阻滞中发挥重要作用.     

电离辐射对小鼠胸腺细胞p16、CyclinD1、CDK4表达的影响

采用流式细胞术 (FCM)检测了不同剂量X射线全身照射后 ,昆明种小鼠胸腺细胞p16、CyclinD1、CDK4蛋白表达的时程变化和量效关系。结果表明 ,2GyX射线照射后 8h小鼠胸腺细胞p16表达明显增高 ,2 4h达到峰值 ,持续至照射后 4 8h ,72h降至正常水平 ;CDK4表达水平在照射后8h明显降低 ,12h降至最低 ,照射后 4 8h恢复近正常水平 ;周期蛋白CyclinD1表达轻度下调。不同剂量 (0 .5 - 4Gy)照射后p16蛋白表达随着剂量的增加而增加 ,2Gy组与假照射组相比显著增多 (p<0 .0 1) ;CDK4蛋白表达在 2Gy照射后明显低于假照射组 (p <0 .0 1) ;CyclinD1表达在 0 .5 - 2Gy照射后可见下降趋势。结果提示 :p16 /CyclinD1/CDK4 /pRb通路在电离辐射诱导胸腺细胞G1期阻滞中可能起着十分重要的作用。     

X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)表达量的变化

用L929细胞染料摄入法检测了小鼠受不同剂量(75mGy,2.0Gy)X射线全身照射后小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)表达量的时程变化及全身照射后24h的剂量-效应关系.结果可见,75mGy照射后3h,TNFα表达量有所增加,从6～120h,均显著高于对照组,12h表达量最高;2.0Gy照射后3～120h,不同时间点均显著高于对照,表达量最高点为12h.从剂量-效应关系中可见,经50mGy～2.0Gy不同剂量照射后,TNFα表达量均显著高于对照组,0.5Gy照射组其表达量最高,而经4.0Gy和6.0Gy照射后,TNFα的表达量显著低于对照组.提示一定剂量电离辐射可诱导巨噬细胞产生TNFα.     

不同剂量γ射线诱导人肿瘤细胞B7.1分子表达的研究

为研究电离辐射与B7.1分子表达之间的关系,探讨肿瘤细胞在照射后免疫原性增强的机理, 采用间接免疫荧光-流式细胞仪测定技术,用不同剂量 γ 射线照射5种肿瘤细胞和一种非肿瘤细胞后,观察不同培养时间内这些细胞B7.1分子的表达水平。用3H-TdR释放试验测定肿瘤细胞和淋巴细胞共反应后细胞毒活性。结果表明,未经照射的肿瘤细胞不表达B7.1分子;经40 Gy照射后,SMMC—772肝癌细胞、PC—12嗜铬神经瘤细胞、A—59肺癌细胞表达B7.1共刺激分 子 , 与 对 照 组 比 有 非 常 显 著 性 差 异 (p<0.01) , 最 高 达(66.8±1.2)%。表达时间以照射后培养72 h时最高。但SHG胶质瘤细胞和HOS骨肉瘤细胞经60 Gy照射后仍无B7.1分子的表达。淋巴细胞与表达B7.1分子的肿瘤细胞共反应后细胞毒活性明显高于未照射组(p<0.01)。     

小剂量辐射诱导哺乳动物细胞对基因突变的适应性反应

预先用小剂量γ射线照射小鼠SR-1细胞,然后观察其对随后大剂量γ射线照射诱发细胞hprt基因突变的影响。0.01 Gy小剂量一次预照射,18h、24h后能显著降低3Gy照射诱发SR-1细胞的hprt基因突变频率。细胞每天接受一次0.01Gy照射,共10d,累积剂量达0.1Gy后,6h就能产生上述效应,并可持续到小剂量刺激后的48h,hprt基因突变频率下降了30%—40%。     

钙结合蛋白S100A8在γ射线损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用

为探索钙结合蛋白S100A8在γ射线对造血免疫系统损伤中的作用,构建S100A8真核表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,研究S100A8在γ射线诱导RAW264.7细胞周期紊乱和胞内活性氧改变中的作用。运用RT-PCR和细胞荧光免疫方法鉴定增强表达S100A8的RAW264.7稳定细胞克隆。流式技术检测10Gyγ射线照射6h后细胞周期及H2O2刺激后胞内活性氧的变化。结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,增强表达S100A8细胞克隆G0/G1期细胞比例增高,S期细胞减少,不发生G2/M阻滞;并且H2O2作用后细胞中活性氧水平低于转染空白质粒的细胞。因此,增强表达S100A8的RAW264.7细胞与转染空白质粒细胞相比对辐射更具抗性,其可能原因是与增强表达的S100A8分子具有抗氧化功能有关。     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和P16蛋白表达的变化

采用RT?PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察X射线照射对离体培养的EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达的影响,证实p16基因转录表达在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中的重要作用。结果表明,2.0GyX射线照射后2—48h,EL?4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平。P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12hP16蛋白表达非常显著高于对照组(p<0.01)。剂量?效应实验表明,0.5—6.0GyX射线照射后12h,?4细胞p16mRNAEL水平明显提高。2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别p<0.01)。研究证实,电离辐射能够诱导EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性。提示辐射诱导p16基因转录表达增加在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中发挥重要作用。     

小鼠扁桃体免疫细胞受照射后DNA双链断裂损伤修复的忠实性

观察了受照射小鼠瓦尔代尔扁桃体环（WRE）在体细胞出现DNA双链断裂修复的忠实性，用^60Coγ射线照后观察WRE细胞凋亡的最高峰，在此时间点处死小鼠，取WRE细胞分别有脂质体和电穿孔方法介导的基因转染技术，将双标记基因质粒pPMH16导入细胞。研究WRE细胞DNA双链修复的忠实性。结果表明，未照射WRE细胞的抗G418转化克隆有69．75％的gpt基因表达，说明大部分断裂的gpt基因被忠实性地修复；2Gy、4Gy射线照射的WRE细胞的转化克隆只有36．05％和21．50％的克隆能正确表达gpt基因功能，说明WRE细胞照射后DNA双链断裂的修复显著低于正常细胞，且剂量越大，修复的忠实性质越低。脂质体和电穿孔方法介导的基因转染技术可用于原代细胞基因转染的研究，照射后的WRE细胞易发生DNA双链断裂错误重接。     

抑制HSP90对缺氧肿瘤细胞辐射敏感性的影响

为研究抑制HSP90对缺氧模拟剂(CoCl2)处理的人宫颈癌Hela细胞的辐射敏感性影响,分别用不同浓度的CoCl2处理Hela细胞24 h进行模拟缺氧处理,用不同浓度的HSP90特异性抑制剂17-DMAG预处理细胞16 h,应用γ射线照射细胞,照射剂量分别为2、4、6和8 Gy,采用克隆形成实验观察细胞的存活率,用Western blot实验检测HIF-1α蛋白表达量变化,用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果显示:用CoCl2处理细胞可以诱导HIF-1α蛋白过表达;不同浓度17-DMAG处理组的Hela细胞在不同照射组间的存活率差异具有显著性(p<0.01);17-DMAG预处理缺氧Hela细胞后,HIF-1α蛋白表达随药物浓度增加受到显著抑制,细胞早、晚期凋亡率随药物浓度增加而增加。结果表明:17-DMAG预处理模拟缺氧细胞可增加细胞辐射敏感性并促进细胞凋亡,其机制可能是通过抑制HIF-1α蛋白表达而发挥作用。     

低剂量X射线对小鼠睾丸生精细胞中凋亡诱导因子变化的影响

采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(Strept actividin-biotin complex,SABC),观察低剂量X射线照射后小鼠睾丸各类生精细胞中(Apoptosis inducing factors,AIF)的表达变化;采用逆转录多聚酶链反应(Reverse transfer polymerase chain reaction,RT-PCR)法观察AIF的mRNA水平变化.研究低剂量X射线对小鼠睾丸生精细胞中凋亡诱导因子AIF蛋白及mRNA水平的影响.研究发现,0～0.2Gy照射后,小鼠睾丸各类生精细胞不同程度表达AIF,以精原细胞和精母细胞表达为主,精子细胞和精子则表达相对较少.AIF表达量与吸收剂量有相关性,0.075Gy照射组表达量最大,且发现AIF蛋白的表达随时间推移而增强,12h达到峰值,然后下降,但仍高于0h组.RT-PCR结果显示,低剂量照射12h后,0.1Gy剂量组AIF mRNA表达量最大.而0.075Gy照射后0-24h,其mRNA表达量逐渐增大,在24h到达峰值.所以,低剂量X线照射诱导小鼠睾丸生精细胞中AIF蛋白及mRNA表达与吸收剂量和表达时间有一定的相关性.     

γ射线诱导人肿瘤细胞B7.1分子表达的研究

为研究电离辐射与人肿瘤细胞B7．1分子表达之间的关系，探讨肿瘤细胞在照射后免疫原性增强的机理。采用间接免疫荧光－流式细胞仪测定技术，用30、40、50、60Gyγ射线照射5种肿瘤细胞和一种非肿瘤细胞后，观察不同培养时间（24、48、72、96h）内这些细胞B7．1分子的表达水平。用^3H－TdR释放试验测定肿瘤细胞和淋巴细胞共反应后细胞毒活性。结果表明，未经熙射的肿瘤细胞不表达B7．1分子。经40Gy照射后，SMMC－7721肝癌细胞、PC－12嗜铬神经瘤细胞、A－549肺癌细胞表达B7．1共刺激分子，与对照组相比有非常显著性差异，但SHG胶质瘤 细胞和HOS骨肉瘤细胞经60Gy照射后仍未B7．1分子的表达。淋马细胞与表达B7．1分子的肿瘤细胞共反应后细毒胞活性明显高于未照射组（p＜0．01）。实验提示，γ射线能诱导人肿瘤细胞表达B7．1分子，增强肿瘤细胞的免疫原性。     

X射线全身照射对小鼠脾细胞cyclin B1 和cdc2基因转录水平的影响

采用Northern blot杂交法研究了低、高剂量X射线全身照射后不同时间小鼠脾细胞cyclin B1和cdc2基因转录水平的变化。结果表明,75mGy X射线全身照射后2h及12－24h小鼠脾细胞cyclin B1 mRNA表达量略有升高,分别为假照组的1.25、1.27和1.22倍,48h回降至假照水平;而2.0Gy照射后4h开始下降,12h降至最低,与假照组相比降低了39％,48h恢复至假照组水平。同时观察了cdc2 mRNA表达量的变化,结果表明,与假照组相比75mGy X射线全身照射后2－48h的各时间点小鼠脾细胞cdc2 mRNA表达量未见明显变化;而2．0Gy照射后的时程变化与相同剂量照射后cyclin B1的变化基本一致。结果提示：低剂量辐射可诱导小鼠脾细胞cyclin B1转录水平增高,进而促进其细胞周期进程,但对cdc2转录水平无影响;相反,较高剂量辐射可诱导cyclin B1和cdc2转录水平均明显降低,最终发生G2期阻滞。     

电离辐射诱导EL-4淋巴瘤细胞G1期阻党政军及相关蛋白的表达

探讨X射线诱导EL－4细胞G1期阻滞及相关蛋白的表达。采用PI荧光标记 ,流式细胞术检测细胞周期的变化。用单克隆抗体免疫荧光标记,流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果表明,2．0Gy和4.0Gy照射后12-72h,G1期EL－4细胞百分数显著高于假照射组（P＜0．05－p＜0.001).4.0Gy照射后EL-4细胞p53蛋白表达从照射后2h开始明显增高,持续至照射后24h(p＜0．05－p＜0．001）;p21蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0.05-p＜0.001);GADD45蛋白表达在照射后2h开始明显增高,持续至照射后48h(p＜0．05－p＜－0．001）;MDM2蛋白表达在照射后4h开始明显增高,持续至照射后24h（p＜0.05-p＜0.01）。结果提示,中等剂量X射线照射可诱导EL－4细胞G1期阻滞。p53、p21和GADD45蛋白表达在电离辐射诱导EL－4细胞G1期阻滞中起重要作用。     

电离辐射联合顺铂对人肺癌细胞中BTG3基因表达的影响

加速器产生的6-MV X-射线一次性照射体外培养的人肺腺癌细胞株A549和SPCA-1,细胞的吸收剂量分别设置为0、1、3、5和8 Gy,细胞照射后24 h及单次接受5 Gy照射后6、12和24 h后取样;X-射线联合顺铂对BTG3表达的影响研究设立单纯照射组(5 Gy)、顺铂处理组(20μmol·L-1顺铂)和联合处理组(5 Gy+20μmol·L-1顺铂),上述实验均以未给予任何处理的细胞为对照组;采用Western blot及RT-PCR法检测受到不同剂量电离辐射及照射后不同时间肿瘤细胞中BTG3表达水平。Western blot与PCR检测结果均显示,A549和SPCA-1细胞在受到不同剂量的X-射线照射后24 h,其BTG3蛋白及mRNA表达量均明显增加,并随电离辐射剂量的增加而增加,与对照组比较有统计学差异(t=5.25-15.75,p0.05);照射后不同时间检测结果显示,细胞在X-射线照射4 h后BTG3蛋白及mRNA的表达量即开始上升,并持续到照射后24 h,与照射前相比有统计学差异(t=7.52-11.18,p0.05);联合处理组BTG3的表达量均明显高于单纯照射组、顺铂处理组和对照组(t=7.02-15.86,p0.05)。电离辐射联合顺铂可以上调肺癌细胞株中BTG3的表达,BTG3基因有可能作为肺癌放化疗的靶基因。     

pEgr-sTRAIL体外转染联合~(60)Co γ射线照射诱导肿瘤细胞凋亡及Caspase-3活化

为探讨Egr-1启动子调控TRAIL基因表达的辐射增敏作用及其作用机制,采用体外瞬时转染pEgr-sTRAIL辐射诱导表达载体联合不同剂量60Coγ射线照射,观察其诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其与凋亡执行分子Caspase-3活化的关系。结果表明重组质粒体外瞬时转染联合不同剂量60Coγ射线照射可诱导肿瘤细胞凋亡,并具有随剂量增高而增加的趋势。Western blot及分光光度法检测Capase-3活性均显示转染重组质粒pEgr-sTRAIL接受不同剂量γ射线照射后,其Caspase-3活性明显增高,亦有随着剂量增高而增高的趋势。提示γ射线可通过激活Egr-1启动子增加TRAIL诱导凋亡及活化Caspase-3的作用从而提高肿瘤细胞的辐射敏感性。     

钴-60伽玛射线诱导淋巴细胞γH2AX表达的研究

采用流式细胞术检测60Coγ-射线照射后γH2AX表达的量效和时程关系,同时探讨紫外线联合60Coγ-射线照射后γH2AX的表达情况。结果表明,不同剂量60Coγ-射线照射后γH2AX表达量与照射剂量之间呈现明显的剂量效应关系。4 Gy 60Coγ-射线照射后,γH2AX的表达在1 h达到峰值,随后逐渐减少。与假照组相比,单纯紫外线照射组γH2AX表达增加,一直稳定维持约6 h左右,随后开始减少。紫外线联合60Coγ-射线照射组与单纯60Coγ-射线照射比较,γH2AX的表达无显著性差异。结果提示采用流式细胞术检测γH2AX的表达估算受照剂量具有可行性,该法有望成为估算辐射剂量的新方法。     

^60Coγ射线照射淋巴细胞诱导PIG3和GADD45基因mRNA变化

用60Coγ射线照射正常人外周血永生化淋巴细胞系后,初步分析受照细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的改变状况,并探讨上述基因作为辐射生物剂量计的可能性及意义.用60Coγ射线照射淋巴细胞,采用不同剂量(0～10Gy)照射和照射后不同时间点(0～72h)收集细胞,抽提mRNA,用Real-time PCR检测细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平的变化.结果表明,正常人外周血永生化淋巴细胞系中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随照射剂量的增高而增加,并呈现出剂量效应关系.5Gy剂量60Coγ射线照射后,淋巴细胞中PIG3和GADD45基因mRNA表达水平随时间的推移不断增高,在8h时均达到最高,随后开始降低.PIG3和GADD45基因对辐射均较敏感,其表达具有良好的剂量效应和时间效应关系,但相比而言,PIG3的表达随照射剂量和照射后时间的变化更加显著,更有潜力作为生物剂量计以满足实际需要.     

~(60)Coγ射线整体照射对小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞在体内原发移行的影响

本文用~(51)Cr 标记细胞方法,研究了经~(60)Coγ射线整体照射后小鼠肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞在同系受体小鼠体内的原发移行。结果表明,供体小鼠经0.5—4Gy~(60)Coγ射线整体照射后,其 MLN 淋巴细胞在同系正常受体体内的原发移行有很大改变。在4Gy 照射组,受体肝脏的标记细胞显著增多;脾脏的标记细胞量在各剂量组均无显著性改变 MLN、肺、回肠的标记细胞量分别在0.5Gy、1Gy、1Gy 照射后开始出现显著性降低。