抗卵巢癌相关抗原CA125单抗及其磁酶诊断试剂的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125(cancer antigen 125)磁酶检测试剂,并进行验证及初步应用。方法应用CA125抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合,筛选效价高、稳定性分泌抗体的杂交瘤细胞株后,接种小鼠腹腔,收集腹水,制备抗CA125单抗,并对其亚型、特异性、相对亲和力、抗原结合位点及抗原决定簇进行鉴定。通优化反应条件制备CA125抗原磁酶检测试剂,并进行验证后,将其应用于50份女性健康体检者及100份卵巢癌患者血清的检测。结果共获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为4B6、2G10、1C2;1C2、4B6和2G10单抗的抗体亚型分别为Ig G2a、Ig G1和Ig G1,轻链均为κ链,相对亲和力依次为2G104B61C2,与AFP、CA50、CEA、CA199、CRP、CA242和小牛血清未发生交叉反应,1C2单抗识别位点与2G10和4B6不同,且3株单抗的抗原决定簇均在CA125蛋白部分上。确定该磁酶检测的反应条件为:包被抗体按100μg/ml,37℃包被1 h;20%小牛血清37℃封闭1 h或4℃封闭过夜;酶标抗体最佳反应时间为45 min。当CA125浓度在10~500 U/ml时,与对应的A450值线性关系良好,R2=0.992;该检测试剂最低检测极限约10 U/ml,灵敏度高;与人血清白蛋白、小牛血清、CA50、CEA、AFP、CRP、CA199和CA242均未发生反应,特异性高;于37℃放置4 d的CA125 A450值与2~8℃相比,差异无统计学意义(P0.05);批内及批间变异系数均10%,重复性较好;高、中、低3个浓度的CA125抗原的回收率在94.45%~105.21%之间,准确性高。50份健康体检者血清中CA125阳性率为4%,100份卵巢癌患者血清中CA125阳性率为88%。结论已成功制备了卵巢癌相关抗原CA125磁酶检测试剂,该试剂具有应用于卵巢癌患者的诊断价值。     

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。     

人催乳素化学发光免疫分析试剂盒的制备及验证

目的制备人催乳素(hPRL)化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒,并进行验证。方法采用2株不同结合位点的抗hPRL单克隆抗体,1株用于包被微孔板,另1株用于标记HRP,建立双抗体夹心检测系统,配合化学发光底物组装成试剂盒,并进行各项技术指标的验证。结果试剂盒最佳定量范围在5～100ng/ml,标准曲线的相关系数r=0.9999,灵敏度为0.49ng/ml,平均回收率为100.9%,试验内和试验间变异系数分别小于6.3%和10.9%。试剂盒有效期可达1年,特异性良好,出现Hook效应的样品浓度为1500ng/ml。与进口化学发光试剂盒和放射免疫分析试剂盒对比检测84份临床标本的结果呈高度相关,相关系数分别为0.9537和0.9486。结论已成功制备灵敏、特异的hPRLCLIA试剂盒,可用于人催乳素的临床检测。     

柯萨奇病毒A组16型抗原定量检测ELISA方法的建立及初步应用

目的建立柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)抗原定量检测的ELISA方法,用于CA16疫苗中抗原的定量检测。方法以纯化的CA16病毒颗粒作为免疫原,分别免疫家兔和BALB/c小鼠,制备抗CA16多克隆抗体和单克隆抗体。以抗CA16多抗作为包被抗体,经HRP酶标记的单抗作为酶标抗体,建立CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,确定该方法的线性范围,并进行准确度、精密度、稳定性及特异性验证。用建立的方法检测CA16疫苗原液制备过程样品中CA16抗原含量。结果以抗CA16多抗为包被抗体,针对74株不同基因型的CA16的ELISA检测结果均为阳性,该抗CA16单抗的广谱性较好。该方法的线性范围为23.4~750 ng/ml,R20.99,最小检出量为23.4 ng/ml;样品回收率在89%~108%之间,CV15%,准确度和精密度较好;抗体包被板干燥后于37℃放置6 d,CV20%,稳定性较好;PV纯化样品、EV71收获液、Vero细胞样品中抗原的A值均小于cutoff值,特异性较好。随着CA16疫苗制备过程的不断进行,中间品1~4比活分别为0.44、0.64、92.13和1 239.03,呈逐渐上升趋势。结论建立了CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,该方法准确度、精密度高,稳定性及特异性较好,为CA16疫苗的研制及工艺开发奠定了基础。     

重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒的研制

目的 制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒，并进行验证。方法 选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体，从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高，且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记)，制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒，并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125～1∶4 000)和酶标抗体稀释度(1∶250～1∶32 000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室，检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以...     

破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒的研制

目的 研制检测破伤风IgG的酶联检测试剂盒。方法 以精制破伤风类毒素进一步纯化后作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG作为抗体制备ELISA试剂盒,并进行敏感性、特异性及重复性检测。结果 试剂盒敏感性可达0.003 9 IU/ml,特异性达95％以上,重复性好,CV<7％,试剂盒置于37℃、7 d敏感性无明显改变。结论 成功地制备了破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

应用重组HBcAg与其单克隆抗体配对检测抗—HBc

抗—HBc单克隆抗体经纯化、酶标后，用作包被抗体和酶标抗体，重组工程菌表达的HBcAg作为联结抗原，选择最佳配对单克隆抗体，用ELISA法检测临床标本593份，其中与Abbott试剂盒对照检测91份，符合率达99．09％，与国内的ELISA试剂盒对照检测502份，符合率达98.1％，证明该单克隆抗体ELISA试剂盒检测抗—HBc的特异性、灵敏度、精确性均属国内领先水平。     

专利文摘

检测阪崎肠杆菌的酶联免疫吸附测试方法及其中所用的抗体;半乳糖浓度的测定方法及半乳糖诊断试剂盒;氨基酸浓度的测定方法及氨基酸诊断试剂盒;新型酶促化学发光免疫检测系统;基于环介导等温扩增技术的沙门氏菌基因快速诊断试剂盒;环介导等温扩增技术的副溶血弧菌基因快速诊断试剂盒;使用动态表面生成和成像来检测生物和化学试剂的系统、方法和试剂;安氏隐孢子虫PCR检测试剂盒;基于聚二甲基硅氧烷的微型生物试剂分析检测芯片;含有经氧同位素标记的血红蛋白的生物体组织检测试剂及其制造方法;二步树脂法制备河豚毒素的方法及河豚毒素制剂。     

鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒的研制

目的研制鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,并进行验证。方法用鼠疫菌F1抗原免疫家兔制备抗血清,经50%饱和硫酸铵盐析2次后,再经Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化,作为包被抗体;制备鼠疫菌F1抗原单克隆抗体腹水,并进行纯化,用HRP标记单抗,作为酶标抗体;建立鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA检测方法,连续制备3批诊断试剂盒,并建立内部质控品。对试剂盒进行板内板间精密性、灵敏度、线性范围、特异性、重复性、准确性和稳定性验证。结果制备的试剂盒检测精密性参比品的板内变异系数为5.2%,板间变异系数为8.23%;试剂盒的线性范围为3.91⁶2.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%62.5 ng/ml,最低检测限为3.0 ng/ml;试剂盒检测鼠疫菌菌液的结果为阳性,而与近缘假结核耶尔森菌无交叉反应;试剂盒检测高、中、低3种浓度F1抗原含量的变异系数为4.54%⁸.4%,回收率在104%8.4%,回收率在104%¹08%之间;试剂盒稳定性良好,有效期至少为1年。结论成功制备了鼠疫菌F1抗原双抗体夹心ELISA诊断试剂盒,为鼠疫的临床诊断及流行病学监测提供了一种快速检测手段,也为新型鼠疫组分疫苗F1抗原含量的检测提供了方法。     

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平。方法用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类。制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价。结果建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链。根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4~1×10-7之间,且均有较好特异性。制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(r=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好。用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43~1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88~2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义。结论已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测。     

抗狂犬病病毒抗体的制备及酶联免疫法的建立

目的制备具有中和活性的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)抗体,并建立检测RV抗原的ELISA法。方法以RV全病毒免疫2只新西兰家兔,制备抗RV多克隆抗体。以RV全病毒免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,建立稳定分泌抗RV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以小鼠中和试验(MNT)检测抗体的中和活性。以ELISA双抗体夹心法和ELISA竞争法检测RV抗原。结果2只家兔的多克隆抗体ELISA效价分别为1∶6.0×103和1∶1.2×104,纯化的兔抗RVIgG中和活性分别为46.3和29.2IU/ml。获得了9株稳定分泌抗RV的单克隆抗体杂交瘤细胞株,属于IgG1或IgG2b亚型,腹水的抗体ELISA效价为1∶1.0×105~1∶1.0×107。单克隆抗体3E5、4C2和4F8具有中和活性,Westernblot分析提示,单克隆抗体4C2是针对RV糖蛋白线性表位的抗体。以单克隆抗体4C2作为捕捉抗体,兔多克隆抗体作为检测抗体,建立了ELISA双抗体夹心法,检测RV抗原。同时建立了另一种ELISA竞争法,加入固定工作浓度的单克隆抗体4C2,与RV病毒液孵育,以ELISA间接法检测RV病毒抗原。结论所获得的狂犬病毒多克隆和单克隆抗体具有中和活性,可在ELISA中用于检测RV抗原。     

化学发光免疫分析法检测人血清孕酮

目的研究用化学发光免疫分析法(CLIA)检测人血清孕酮(PROG)。方法采用竞争抑制法,用高亲和力的多克隆抗体包被,碱性磷酸酶标记孕酮,金刚烷增敏化学发光体系作为酶底物来检测PROG。并考察试剂的灵敏度、精密性、准确性、特异性和测定范围。将试剂盒置4℃存放14个月,检测质控血清的PROG含量,考察试剂的稳定性。并与进口试剂进行比较。结果CLIA法检测PROG灵敏度达0.1ng/ml;特异度99.5%;测定范围在0.1～200ng/ml之间;用PROG浓度分别为高、中、低的质控血清测定精密性,批内和批间变异系数均小于10%,回收率在91.7%～108.4%之间;与雌二醇、雌三醇和雌酮的交叉反应率低于0.1%,与睾酮和可的松无交叉反应;试剂在4℃存放14个月,质控血清的测定值均在规定范围内;与进口全自动化学发光试剂BeckmanAccessTM相比有较好的相关性。二者测定结果的符合率为99.2%。结论化学发光法灵敏度高,特异性好,稳定性强,检测范围宽,有很好的准确性和精密性,是现有放射免疫法的理想替代方法。     

血管内皮细胞生长因子的表达及其单克隆抗体的制备

目的表达、纯化血管内皮细胞生长因子(VEGF165)蛋白,并制备其单克隆抗体。方法将pGEX-4T-1/VEGF165表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达GST-VEGF165融合蛋白,并采用十二烷基肌氨酸钠溶解,亲和层析纯化。用获得的GST-VEGF165蛋白免疫小鼠,制备抗GST-VEGF165单克隆抗体,并进行鉴定及初步应用。结果表达的GST-VEGF165融合蛋白相对分子质量约为45000,表达量约占菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度大于90%,并具有与其受体结合的活性,亲和力约为109L/mol。免疫小鼠后,获得1株抗GST-VEGF165的单克隆抗体,反应原性良好,亚类为IgG2a,解离常数为2×10-9mol/L。以此单抗为包被抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,VEGF165的最佳检测范围为1.5625～25ng/ml。结论成功表达、纯化了VEGF165蛋白,并制备出VEGF165单克隆抗体,为VEGF检测试剂盒的研制奠定了基础。     

抗重组人白细胞介素-12单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备抗重组人白细胞介素-12(rhIL-12)单克隆抗体(McAb),并建立检测IL-12的双抗体夹心ELISA方法。方法以纯化的rhIL-12(p70)免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测胃癌患者术前、术后血清IL-12水平的变化。结果筛选出3株稳定分泌抗rhIL-12的单抗杂交瘤细胞株,纯化后单抗纯度达95%以上。免疫球蛋白亚类2株为IgG1,1株为IgG2a,轻链属!型,相对亲和力依次为EM5>EM6>EV9。Western blot及ELISA交叉试验表明,单抗具有良好的特异性。建立的双抗体夹心ELISA方法检测rhIL-12的最低检出限为20pg/ml,线性范围为25～3200pg/ml。应用此法检测胃癌患者术前血清IL-12水平较正常对照组明显降低,术后10d明显升高。术后给予免疫增强型NE组IL-12水平较未给予组明显升高。结论制备的抗rhIL-12单克隆抗体,能够用于IL-12的体内外免疫学检测,为IL-12的研究、检测及临床应用奠定了基础。     

鼠抗人间变性淋巴瘤激酶单抗及其试剂盒的制备及鉴定

目的制备并鉴定鼠抗人间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)单抗及其试剂盒。方法以人ALK重组蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备人ALK单抗,ELISA及免疫细胞化学(immunocytochemical,ICC)法筛选稳定分泌ALK单抗的杂交瘤细胞株;SDS-PAGE检测单抗纯度;蛋白定量测试检测单抗浓度;ELISA方法检测单抗效价、亲和力;单抗亚类检测试剂盒鉴定单抗亚型;Western blot及免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)法鉴定单抗的特异性。IHC方法筛选ALK单抗检测试剂盒配套的相关试剂,应用制备的ALK单抗试剂盒及抗ALK(D5F3)兔单抗试剂(IHC法)分别检测1 162份临床样本。结果共筛选出3株稳定分泌ALK单抗的杂交瘤细胞株,其中细胞株1A4在IHC检测非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中ALK蛋白时表现强阳性。单抗1A4的浓度、效价及亲和常数分别为6.791 mg/mL、1∶51 200和2.75×109 L/moL,抗体亚型为IgG2b。在不同肺癌细胞系及过表达ALK和其他基因的细胞裂解液中,单抗1A4仅识别ALK蛋白,在多种NSCLC病理组织样本中可鉴定出ALK阳性的NSCLC,特异性高。选择EDTA修复液(pH 9.0)、DAB染色液(增强聚合物法)及中杉金桥生物科技有限公司的抗体稀释液作为试剂盒配套试剂。1 162份临床样本经ALK单抗试剂盒与抗ALK(D5F3)兔单抗试剂(IHC法)检测的ALK阳性及阴性结果一致性良好。结论成功制备了特异性强的鼠抗人ALK单抗(1A4),该ALK单抗试剂盒与抗ALK(D5F3)兔单抗试剂(IHC法)检测结果一致性良好,可用于NSCLC中ALK蛋白的检测。     

抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠的制备及初步应用

目的制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,并进行初步应用。方法采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗荧光素单克隆抗体;制备腹水,经50%硫酸铵粗提后,再经阴离子交换树脂DE52进一步纯化单克隆抗体;采用氧化共沉淀法制备纳米磁性粒子;乳液聚合法制备羧基磁性微球;用碳二亚胺将抗荧光素单克隆抗体共价偶联于磁性微球表面,制备抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠。用制备的免疫磁珠检测乙肝表面抗原,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果共获得5株杂交瘤细胞株,其中1F12细胞株分泌的抗体效价、相对亲和力较高,特异性较好;纯化的1F12株单抗的纯度达95%,蛋白含量为2.4 mg/ml,ELISA效价为106,相对亲和力为0.2 mg/L,与FITC标记的BSA可特异性结合;纳米磁性粒子的平均粒径为150 nm,铁含量为71.63%;羧基磁性微球的平均粒径为210 nm,羧基含量约为2.15 mmol/g;每克羧基磁性微球可结合抗荧光素单克隆抗体约12 mg,制备的免疫磁珠可有效结合荧光素标记的蛋白。应用抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠检测乙型肝炎表面抗原的灵敏度高于ELISA试剂,检测限达0.1 ng/ml。结论成功制备了抗荧光素单克隆抗体免疫磁珠,其具有应用于免疫检测分析的价值。     

抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备

目的制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂。方法采用ELISA间接法。先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其最适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其最佳使用浓度。对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果的相关性进行考核。结果抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的最适浓度分别为10!g/ml和1∶1500,试剂灵敏度为0.072IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5d检测样品结果与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果呈正相关。结论所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测。