基于滚环扩增技术的DNA水凝胶的设计与制备

DNA水凝胶是DNA分子链在水溶液中交联形成的三维网状结构,是生物技术及新材料领域的研究新热点。由于DNA分子卓越的特异性与可设计性,利用DNA分子形成具有拓扑结构的DNA水凝胶在实现水凝胶可设计性的同时也能具有智能响应性,在药物运输、生物传感等领域展现出广泛的用途,但该凝胶的制备仍然面临成本高昂及成胶效率低下等问题。滚环扩增技术作为一种新型的酶介导等温扩增方式,极大地节省了合成成本,同时也为单链DNA的有效扩增提供了新的方法,将凝胶的制备变得方便快捷,并且在此基础上赋予其独特的性质。本综述主要介绍了近年来基于滚环扩增制备的新型DNA水凝胶,并对其设计理念、形成机理、优势与难点进行讨论。     

治疗性DNA疫苗生产工艺及质量检测的研究

研究了治疗性DNA疫苗的大规模生产工艺.利用硫酸铵沉淀法和超滤技术对发酵菌体的碱裂解液进行预处理,除去发酵液中大量的RNA;然后依次用凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析对DNA疫苗进行纯化;并对最终质粒DNA溶液进行全面的质量检测.结果表明,DNA疫苗总产率可达62%,各项质量指标均符合药用DNA疫苗质量标准.该纯化工艺操作简便、成本低,适用于大规模工业化生产.     

肿瘤基因疫苗纯化工艺的建立

目的建立肿瘤基因疫苗的纯化工艺,为肿瘤基因疫苗的工业化生产奠定基础。方法采用碱裂解法粗提质粒DNA,利用凝胶过滤层析、亲和层析及离子交换层析分离纯化质粒DNA,并对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果经3种层析柱纯化所获得的超螺旋质粒DNA,其A260与A280的比值在1.85～1.92之间;超螺旋质粒DNA比例不低于94%;内毒素含量远低于10EU/mg;5批纯化的质粒DNA经全面检定,均符合国家质量标准。结论该纯化工艺制备的肿瘤基因疫苗纯度高,且有效去除了内毒素。     

基于琼脂糖凝胶集成样品预富集功能的微流控芯片

提出了一种基于微注模技术的琼脂糖凝胶微流控富集检测芯片,该芯片利用与传统电泳技术兼容的琼脂糖凝胶作为芯片主体材料,并利用微注模的方法在特定区域形成琼脂糖凝胶纳孔膜结构,以此纳孔膜结合电泳作用实现样品预富集。初步富集实验实现了DNA样品在10 s内8.2倍的浓缩。     

基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制

目的建立基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定。方法采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA。纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量。结果经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA。获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5%;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9%(P<0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg。结论建立了基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础。     

pH及温度敏感性N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚微凝胶的制备与表征

通过无皂乳液聚合得到了N-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的无规共聚物微凝胶,用电导仪测定了该微凝胶的表面羧基含量,用分光光度计测定了水凝胶溶液透光率在不同pH值和温度条件下的变化。结果表明,该微凝胶表面羧基含量随着聚合反应中丙烯酸质量分数的增加而增大;微凝胶表面羧基含量直接影响微凝胶的环境敏感性。     

温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)/聚丙烯酰胺互穿网络水凝胶

采用紫外引发法制备了物理交联的聚(N-异丙基丙烯酰胺)和化学交联聚丙烯酰胺为组分的互穿网络水凝胶。利用FFIR对所得的凝胶进行了结构分析;测定了该水凝胶在20℃时的溶胀率和50℃时的水保持率;利用DMA和DSC分别研究了水凝胶的储能模量随温度的变化及相转变行为。结果表明:与聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶相比,该水凝胶有较好的溶胀率;且具有超快的响应速率,如10 min内失去90%的水;其储能模量增加;虽然其相转变行为变弱,但临界溶解温度(LCST)有所提高。     

适用于海上S油田的泡沫凝胶体系的研制与评价

针对海上油田开采后期非均质性增大,优势通道明显,水窜严重等问题,合成了一种泡沫凝胶体系,并评价了该体系的溶液性能与驱油能力。通过实验测试,分析结果表明:研制的泡沫凝胶体系配方为:AP-P4聚合物3000 mg/L+起泡剂500 mg/L+交联剂(EC)30 mg/L;泡沫体系遇水稳定遇油相融,具有堵水不堵油的特点;凝胶体系具有很好的热稳定性,是性能优良的稳泡剂;该泡沫凝胶体系与聚合物组合能够显著提高采收率。     

磁性半纤维素接枝聚丙烯酰胺凝胶对亚甲基蓝的吸附研究

利用自由基聚合和原位共沉淀法制备了1种磁性半纤维素接枝聚丙烯酰胺凝胶,研究了该凝胶吸附亚甲基蓝的性能,特别考察了凝胶用量、pH、吸附时间、亚甲基蓝初始含量等因素对吸附的影响。结果表明,磁性凝胶用量增大,凝胶单位吸附量下降;pH增大,凝胶吸附量增加;初始亚甲基蓝的质量浓度从25 mg/L增加到250 mg/L,凝胶吸附量不断增大。凝胶吸附亚甲基蓝的动力学符合准2级动力学方程,Langmuir、Freundlich和Temkin吸附等温线模型均能很好地拟合凝胶对亚甲基蓝的吸附过程。     

磺化β-环糊精/PVA凝胶电刺激响应行为的研究

首先将β-环糊精(β-CD)和聚乙烯醇(PVA)用戊二醛交联制成凝胶;然后以浓硫酸作为改性剂,将磺酸根引入凝胶中,制备出一种阴离子型磺化β-CD/PVA凝胶,并对该凝胶的平衡溶胀率、粘接性能和电刺激响应行为等进行了研究。结果表明:该凝胶在Na2SO4水溶液中的平衡溶胀率随离子强度增加而减小;其剪切强度随PVA含量增加呈先升后降态势,并且在w(PVA)=5%时相对最大(3.8 MPa)。在非接触性直流电场作用下,该凝胶在Na2SO4水溶液中弯向电场负极,其弯曲偏转速率和应变随外加电压增加而增大,并且在离子强度为0.15 mol/L时相对最大;在循环电场作用下,该凝胶的电刺激响应行为具有良好的重现性和可逆性。     

一种重组融合抗菌肽ClavE-HD5的原核表达

根据海鞘Clavanins抗菌肽(ClavE)氨基酸序列和人HD5氨基酸序列,设计了一个融合的新抗菌肽ClavEHD5,通过PCR方法以大肠杆菌偏好密码子合成该融合重组肽的编码DNA,将该DNA克隆到大肠杆菌表达载体pET30α中,构建了ClavE-HD5的融合表达质粒。测序结果表明,克隆分子序列正确,可以表达1个12kDa的带标签融合蛋白。经转化大肠杆菌表达菌株E.coli Rosetta(DE3)后,以IPTG诱导并经Tricine-SDS-PAGE检测发现,凝胶中出现预期大小的多肽带,表明成功表达出重组的ClavE-HD5的融合抗菌肽。     

环氧—甲基丙烯酸树脂的固化特性研究

本文研究了EAM树脂的凝胶特性,用DSC、IR研究了树脂的固化特性。结果表明,BPO含量增加或升温,可使凝胶时间缩短;Tgel约100℃,Ttreat约120℃;并制定了该树脂的固化工艺。     

东河油田深部调驱技术实验研究

针对东河油田油藏地层压力高、温度高和地层水矿化度高的特点,选用耐温耐盐聚合物SD7000研究并优化了适合该油藏的凝胶调驱体系,该体系配方为聚合物0.6%+高温交联剂0.3%+稳定剂0.08%+性能改进剂0.04%。评价了温度、矿化度、p H值三个因素对凝胶体系成胶性能的影响,结果表明:随着温度的升高,成胶时间变短,凝胶粘度先变大后变小;对p H值适用范围广,p H值在8~10时,成胶时间较短,凝胶粘度较大;随着钙离子浓度的增加,成胶时间变短,凝胶粘度基本不变;室内封堵实验表明,该凝胶体系封堵率达98%以上,具有一定的堵水作用。该研究对东河油田进一步提高水驱采收率提供了理论基础和技术支持,具有重要的指导意义。     

人用Vero细胞狂犬病疫苗的纯化

根据WHO关于批准使用传代细胞生产生物制品的规定,以及1986年审议通过的用传代细胞生产人用狂犬病疫苗的规程,应用狂犬固定毒CTN-V1株在ATCC株Vero细胞中培养,收获的病毒液用美国Millipore生产的30万MW的超滤系统浓缩,再用1/2000的硫酸鱼精蛋白处理去除传代Vero细胞的DNA,然后用瑞典Pharmacia公司生产的Sepharose4B凝胶进行凝胶过滤层析纯化,用流动紫外检测仪的280nm检测蛋白吸收,经ELISA检测确定较小的前峰为狂犬病毒蛋白峰。该峰分离液经蛋白含量测定,证实杂蛋白去除率最低为99.81%,小牛血清残留量小于50μg/ml,细胞DNA残留量…     

环氧—甲基丙烯酸酯树脂的固化特性研究

本文研究了EAM树脂的凝胶特性 ,用DSC、IR研究了树脂的固化特性。结果表明 ,BPO含量增加或升温 ,可使凝胶时间缩短 ;Tgel约 10 0℃ ,Tcure约 110℃ ,Ttreat约 12 0℃ ;并制定了该树脂的固化工艺。     

盐酸米诺环素原位凝胶的流变学研究

采用振荡模式考察了盐酸米诺环素原位凝胶体系的流变学性质。结果表明,盐酸米诺环素原位凝胶溶液态为一种假塑性流体,非牛顿流体;原位凝胶遇水后弹性模量、粘性模量及复数粘度增大,而相角减小,原位凝胶中的高分子材料分散状态改变,发生时间依赖性的相转变。该体系为一种溶剂敏感型原位凝胶。     

纤维素/萘酐衍生物复合水凝胶的制备及其荧光性能研究

首先优化合成手段合成了不同位点上具有不同取代基的萘酐衍生物(DNA和DPN),然后用绿色溶剂氢氧化锂(LiOH)/尿素/水溶解纤维素,并通过工艺简单的化学交联水凝胶制备方法,首次制备了纤维素/DNA复合水凝胶(DNACH)和纤维素/DPN复合水凝胶(DPNCH),并通过紫外分光光度计测定纤维素荧光紫外吸收光谱,利用荧光光谱仪测定其荧光发射光谱,研究了随着时间变化,荧光纤维素水凝胶的发射光谱的变化。结果表明,杂化荧光水凝胶与荧光小分子在紫外谱图上有较大的波长位移变化,证明了新的体系的生成。DNACH、DPNCH荧光杂化水凝胶的最大荧光发射对应的波长分别为540、570nm,所对应的掺杂浓度均为2×10~(-4) mol/L。在同一掺杂浓度下,DPNCH具有最大荧光发射强度,这与DPN小分子的推电子基团和大的共轭结构有关,因此DPN小分子在制备具有高荧光的纤维素杂化材料时是很好的备选材料。     

共聚物水凝胶角膜接触镜材料的初期脱水行为

以N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯以及甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯或者甲基丙烯酸丁酯为原料,制备共聚物水凝胶角膜接触镜材料,建立了膜状水凝胶材料的脱水模型,采用重量法和热失重法研究了该材料的初期脱水行为.结果表明,水凝胶膜的初期脱水速度与其交联密度的平方成反比;共聚物水凝胶中N-乙烯基吡咯烷酮的含量越大,脱水速率越大;甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯以及甲基丙烯酸丁酯的含量越大,脱水速率越低,以甲基丙烯酸乙酯最明显;在初期脱水阶段,水凝胶膜的脱水行为可用一级动力学描述.     

一种新型超分子复合水凝胶的制备与性能研究

本文利用合成得到的GLD凝胶因子与海藻酸盐水凝胶制备出一种新型的复合水凝胶GSC,研究了该凝胶的凝胶化转变温度、微观形貌和药物释放行为。当凝胶因子浓度和海藻酸钠浓度增大时,GSC复合水凝胶的三维网络结构会随之变致密,凝胶化转变温度增高,药物释放率降低。盐酸环丙沙星在该水凝胶中的药物释放率还会受到环境pH和温度的影响。     

应用复合纯化介质Capto Core700纯化狂犬病疫苗

目的应用复合凝胶Capto Core700作为纯化介质去除狂犬病疫苗中的Vero细胞宿主蛋白和宿主细胞DNA等杂质。方法将Vero细胞接种至微载体,在celligen plus生物反应器中培养,按MOI=0.002接种狂犬病病毒,连续制备10批狂犬病疫苗原液。经过滤及浓缩后加入β-丙内酯,于2~8℃灭活24 h,获得病毒灭活液。上样至装载复合凝胶Capto Core700的纯化柱进行层析纯化,并按《中国药典》三部(2015版)的方法检测宿主细胞蛋白去除率、宿主细胞DNA去除率、狂犬病病毒糖蛋白回收率及总蛋白去除率。同时与传统Sepharose系列凝胶纯化方法进行比较。结果 10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为58.3%~63.2%,宿主细胞DNA去除率均90%,糖蛋白回收率范围为52.3%~74.5%,蛋白去除率范围为7.22%~11.76%。与传统Sepharose系列凝胶纯化方法比较,差异较小,且Capto Core700的上样量为3倍柱体积,高于Sepharose凝胶(15%)。结论 Capto Core700凝胶可有效去除狂犬病疫苗中的杂质,缩短了纯化工艺时间。