细菌纤维素产生菌的筛选、鉴定及其产物分析

以自然发酵的椰子水为材料进行筛选,获得细菌纤维素高产菌株.通过平板分离、静态发酵等方法,获得一株细菌纤维素产量为10.8 g/L的菌株BC13.经过形态特征、生理生化特征以及16S rDNA等方面的分析,菌株BC13被鉴定为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus);其发酵产物经蒽酮法显色分析、红外光谱分析和扫描电镜观察,被证实为细菌纤维素.     

细菌纤维素静态发酵生产的动力学模型的确定

对静态发酵生产细菌纤维素的动力学模型进行了研究,初步建立了细菌纤维素静态发酵生产的动力学模型.     

响应面法优化产细菌纤维素菌发酵条件

为了提高细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)的产量,以本实验室筛选出的产BC菌Komagataeibacter rhaeticus TJPU03(K. rhaeticus TJPU03)作为研究对象,通过响应面法设计实验优化BC的生产条件。将优化内容分为两部分:培养基组分和外部因素。利用软件Design expect 8.0计算和优化BC的最佳生产条件。结果表明:当外部条件为温度28.52℃、初始pH值3.0、接种量8.87 mL以及发酵培养基组分为葡萄糖1.58%、酵母粉0.66%、蛋白胨0.42%、柠檬酸0.12%、磷酸氢二钠0.3%时,实际BC产量可达6.7432 g/L,较未优化前显著提高。     

细菌纤维素生物合成网络的构建及代谢通量分析

构建了木醋杆菌合成细菌纤维素（Bacterial Cellulose，简称BC）的代谢网络基于流量平衡模型，通过物料衡算和Lingo线性规划，得到发酵前期和后期BC合成的代谢通量分布．代谢通量分析结果表明，葡萄糖进入磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸（TCA）循环，前期菌体大量合成，BC产量较高；后期形成大量无效循环，BC产量降低．由于部分代谢流流向副产物和无效循环，减少了合成BC的代谢流，造成了碳源的浪费，所以需通过遗传改造、诱变或改变发酵条件等方法，减少副产物生成，提高BC的产率．     

细菌纤维素发酵条件的研究

本文通过正交原理设计试验，对醋酸杆菌生产细菌纤维素发酵条件进行了研究。结果表明：（1）通过醋酸杆菌发酵能够生产细菌纤维素：（2）醋酸杆菌发酵最佳工艺为；pH5.0,20℃，苹果汁加量100ml，发酵时间5-7d;(3)醋酸杆菌生产纤维素是一种无污染的清洁生产工艺。     

里氏木霉Swollenin在毕赤酵母中的表达

通过设计合适的引物,经RT-PCR方法从里氏木霉的总RNA中扩增出Swollenin基因,并将该基因连接到PMD18-T Simple载体,得到该基因的克隆菌株,经酶切并将该基因连接到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA-swo1.将该重组质粒线性化后,通过电转化方法转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株P. pastoris-swo1.该菌株的发酵液可使滤纸纤维强度降低,纤维素膨胀及崩解效果明显,表明重构表达的Swollenin可用于木质纤维素的预处理.     

芽孢杆菌 BC4 铬抗性相关基因 chrA 的克隆表达

以芽孢杆菌 BC4 菌株为对象，通过对其铬抗性相关基因 chrA 的克隆表达来测定其编码蛋白 ChrA 还原 Cr(VI)的能力以及该蛋白在芽孢杆菌 Cr(VI)去除中的作用，可帮助进一步阐明芽孢杆菌与 Cr(VI)的作用机理，并 为芽孢杆菌应用于铬污染治理奠定理论基础。PCR 扩增出芽孢杆菌 BC4 菌株铬抗性相关基因 chrA，PCR 产物经 克隆与测序，得到 chrA 完整的 DNA 序列。该序列大小为 1182bp，共编码 393 个氨基酸，预测编码蛋白分子量 为 43kDa。根据利用 NCBI 所进行的 BLAST 序列比对结果，判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将 chrA 基因 PCR 产物双酶切后连接到表达载体 pET28b 并转化进大肠杆菌 BL21 中，对其表达产物进行分析。结果表明，chrA 基因在大肠杆菌 BL21 中表达约 43kDa 的蛋白，与预期结果相符；重组菌株对 Cr(VI)的耐受能力高于对照菌株， 说明 ChrA 蛋白在芽孢杆菌 BC4 的 Cr(VI)抗性机制中起重要作用，且重组菌株对 Cr(VI)具备较强的抗性。     

一步法由纤维素生产乙醇的研究现状

由纤维素物料生产乙醇的传统研究采用酶解后再发酵的“两步”法。更为优良的工艺应是“一步”的微生物方法,该法共同特点是将各自独立的过程在同一反应器内完成。一步法可分三类:(1)SSF 法在同一容器内使用纤维素酶和糖酵解菌,该法可提高纤维素水解速率并增加乙醇得率。其工艺影响因素为酶浓度、温度、pH、底物浓度及预处理。(2)纯培养发酵该法使用某些能水解纤维素产生乙醇的细菌(多为梭菌与瘤胃菌)直接发酵。(3)共培养发酵使用纤维素水解菌与糖酵解菌的共培养发酵可进一步提高发酵速率、纤维降解率、乙醇得率及浓度。其发酵关键在于控制培养基中氧气含量、取得高的底物浓度、低的副产物量及进一步做好育种工作。     

秸秆降解菌株的诱变选育及发酵条件的研究

为提高纤维素酶活性,获得降解秸秆能力强的菌株,采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法处理绿色木霉(Trichoderma viride)菌株,通过刚果红培养基初筛并进行10代PDA斜面继代培养和液体发酵复筛,选择纤维素酶活性高的菌株,以秸秆为底物进行液体发酵条件优化.结果表明:选育出6株稳定高产纤维素酶的绿色木霉(T.vi...     

磷脂酸磷酸酶在酿酒酵母中的过表达及表型分析

磷脂酸磷酸酶(PAP)是一类重要的去磷脂酸酶,该酶的低水平表达会降低酿酒酵母细胞对外源脂肪酸的耐受性,从而阻碍了改造酿酒酵母使其生产多不饱和脂肪酸的研究进程。本实验克隆获得磷脂酸磷酸酶的编码基因PAH1,构建了过表达PAH1的酿酒酵母重组菌株BY-PAH。限氮发酵72 h后,重组菌株BY-PAH胞内油脂浓度较对照菌株BY4741提高了49%。当在培养基中添加棕榈油酸浓度从0.25 mmol/L提高到1 mmol/L时,重组菌株BY-PAH的胞内油脂浓度从26.7%提高到38.5%。该结果表明,磷脂酸磷酸酶通过其自身的去磷酸化活性能够将更多的脂肪酸整合到甘油三酯TAG上,使酿酒酵母对脂肪酸有更高的耐受性。     

响应面法优化短短芽孢杆菌S1039发酵培养基的研究

近年来,传统抗生素的过量使用导致动植物病害耐药性增强,这不仅使得抗生素的作用越来越小,而且严重威胁着人类的健康.因此寻找高产细菌素或类细菌素的微生物菌株成为研究的热点.本研究为了提高短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis S1039)类细菌素的抑菌活性,对其发酵培养基进行了响应面优化.通过单因素试验筛选出了适合短短芽孢杆菌产抗菌物质的最佳碳源、氮源分别是马铃薯淀粉和蛋白胨,并发现适量的CaCl_2和Tween-20能够有效的促进类细菌素的产生.利用Box-Behnken实验设计及响应面分析确定了培养基四个因子的最佳浓度分别为:马铃薯淀粉12.9g/L、蛋白胨27.6g/L、CaCl_21.2g/L、Tween-20 1.05%.采用优化后的培养基发酵,类细菌素抑菌圈直径达到25.4mm,比优化前提高了56.8%,说明响应面法优化短短芽孢杆菌发酵培养基能够明显的提高类细菌素的抑菌活性,为该菌株规模化生产类细菌素提供了基础应用参考.     

污泥和水葫芦混合发酵产氢的影响因素分析

以沼气池污泥和水葫芦为混合发酵底物,以活性污泥煮沸处理后扩大培养的优势产氢菌株为接种物,研究其发酵产氢特性及影响因素.试验表明,在沼气池污泥底物中必须加入优势产氢菌株作接种物才能发酵产生大量H2;利用水葫芦作发酵底物时必须预先剔除其富含重金属的根部以防止对产氢细菌的抑制作用;富含纤维素等复杂大分子的水葫芦必须经过酸碱和酶解等预处理才适于细菌发酵产生大量H2;污泥和水葫芦混合发酵过程中必须适当处理浮渣以使得大量H2能及时导出,否则反而会抑制细菌的产氢代谢导致产氢能力明显降低.试验在沼气池污泥中加入优势产氢菌株作接种物时得到的产氢能力最高,单位产氢量为116.3mL/gTS,平均氢气浓度为64.95%.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵卜异亮氨酸产量的影响．以L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW基因组为模板克隆horn基因,将horn基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入Cglutamicum YILW构建C．glutamicum YILW（pXMJ19．hom）．通过5L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响．结果显示,重组酶的表达使菌株对卜苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强．最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36．5g／L和2．8g／L,分别较出发菌株提高7％和33％,同时L-赖氨酸合成量仅为2．1g／L,较出发菌株降低了63．8％．     

木质纤维素水解物生物脱毒的研究进展

利用木质纤维素通过稀酸处理生产乙醇的过程中会产生大量影响发酵的毒素物质,而筛选特异性微生物选择性地去除这些酵母发酵代谢抑制物,是一种经济环保的脱毒方法。本文综述了近年来木质纤维素水解物生物脱毒的研究进展,系统地介绍了木质纤维素稀酸水解物的构成和水解物毒素的形成及毒性作用,分析了脱毒菌株的筛选途径及微生物脱毒效应,阐述了生物脱毒微生物与发酵酵母的协同效应以及耐毒或脱毒代谢工程菌的构建,提出了木质纤维素水解物微生物脱毒发酵生产乙醇的研究方向,并对未来的发展前景进行了展望。     

一株生孢噬纤维细菌的16S rDNA 基因序列分析

利用双层平板法从土壤中分离获得了一株能够降解纤维素的好氧性滑动细菌--生孢噬纤维细菌Sporocytophaga sp.JL02,通过菌株基因组DNA的提取、16S r DNA的PCR扩增及克隆、16S r DNA的全序列分析等手段,对该菌株的16S rDNA的基因序列进行了研究.通过扩增,得到了一长度为1560bp的16S rDNA的基因,并对其基因序列进行了分析.     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

细菌纤维素生产菌的常压室温等离子体诱变育种及发酵条件优化

采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对目的菌株Komagataeibacter xylinus进行诱变,选育BC高产株,经10次传代发酵验证其遗传性较稳定。在单因素试验基础上,以BC产量为响应值,采用Plackett-Burman、Central composite design试验设计法进行响应面分析。结果表明,高产菌株G31的最佳发酵工艺条件为葡萄糖∶甘露醇(1∶1)4.0 g·(100 mL)~(-1)、MgSO_4·7H_2O 0.13 g·(100 mL)~(-1)、冰乙酸0.25 mL·(100 mL)~(-1)。在此发酵条件下,BC产值为8.49 g·L~(-1),与预测值8.61 g·L~(-1)相差不大,是初始菌株发酵产量的2.53倍。     

赤霉菌原生质体外源基因高效转化方法研究

赤霉素(gibberellic acid,GA)是一种非常重要的植物生长调节剂,具有促进植物种子萌发和生长等功效.生产上用的赤霉素主要通过水稻赤霉病菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)工业发酵而来.赤霉菌工业生产菌株不产生孢子,不易进行以孢子为受体的外源基因转化.本研究建立了工业赤霉菌原生质体制备以及以原生质体为受体、利用电击高效转化外源基因的方法.结果发现崩溃酶(Dryslase)和溶壁酶(Lysing enzyme)以3:7的质量比混合时对赤霉菌原生质体的制备效果最好.电压为0.8～1.0kV的范围内原生质体的转化率最高,1μg DNA可以得到18个转化子.提供的方法不仅可以用于藤仓赤霉工业菌株的遗传改良,还可以用于水稻赤霉病菌分子生物学研究.     

ATCC碱性纤维素酶产生菌产酶特性的重新确定

研究美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供的菌株ATCC21833(HorikoshiK定名为芽孢杆菌Bacillussp.N4)的纤维素酶合成基因后,发现该基因与HorikoshiK定名的N4基因并不具有同源性.为此重新研究了该菌株的产酶特征和所产生碱性纤维素酶的部分酶学特性.结果表明,羧甲基纤维素为最适宜的碳源,在以羧甲基纤维素、蛋白胨和酵母抽提物为主要组分的培养基中进行培养,碱性纤维素酶的活性可以达到0.64U/mL,所产生的碱性纤维素的最适pH值为10.0,最适反应温度为40℃.其产酶特性和酶学性质和N4菌株有较大差异.