应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。     

应用EHF cDNA探针检测人用鼠源性杂交瘤细胞和单抗制剂

从R3 克隆中提取并纯化流行性出血热R2 2 株M片段cDNA ,用光敏生物素标记而制备出生物素化的cDNA探针。用此探针与R2 2 株、76 118株及R3 克隆进行斑点杂交 ,均出现阳性杂交信号 ,而与仙台病毒、鼠肺炎病毒及BALB/c小鼠肝细胞、Vero E6细胞和SP2 / 0细胞杂交均为阴性。探针的灵敏度为 2 5pg目的核酸。用此探针测定了来自 9个单位 12株人用鼠源性杂交瘤细胞和 7个单抗制剂均为阴性。该结果与血清学检验结果一致     

应用生物素探针检测重组人α_1型干扰素中外源DNA

本文应用生物素标记重组人α_1 型干扰素(rHuIFN-α_1)工程菌的总DNA作为探针,检测rHuIFN-α_1制品中的外源DNA,其灵敏度可达10pg。用蛋白酶K(Proteinase K)消化制品中的蛋白,排除了使用生物素所常见的非特异性影响。     

用地高辛配基标记探针检测基因工程人β干扰素制品中的外源DNA

β型人基因工程干扰素（rhIFN-β）是人β干扰素基因在异种细胞中表达的产物，它的生物学功能与自然的没有区别，而且蛋白的均一性更高。由于rhIFN-β用异种细胞表达，终产品中可能污染外源DNA。按WHO的要求，基因工程产品中外源DNA的含量不得大于100pg／剂．因此，建立敏感、特异的外源DNA含量检测方法十分必要。本实验用中国预防医学科学院病毒学研究所提供的工程菌，经超声裂解、部分提纯和提纯，取得纯度为96%、比活性为1．02×107IU／mg的rhIFN-β蛋白，提纯后的工程首全DNA经不同处理，标记两个探针，即全DNA直接用lug标…     

CHO宿主细胞DNA残留量检测方法的建立

目的建立检测生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的方法,制备检测CHO细胞DNA残留量的内部参考品,为国家相关标准的制定和修订提供依据。方法分别采用酚:氯仿:异戊醇抽提、DNA提取试剂盒和高盐抽提3种方法提取CHO细胞DNA,比较3种方法的提取效果;用地高辛标记最佳方法提取的CHO细胞DNA探针,并优化标记体系,直接法检测探针的标记效率;采用3种方法处理CHO细胞DNA内部参考品(1组不作处理;2组加入牛血清白蛋白和蛋白酶K;3组按2组方法处理后,增加DNA抽提步骤),通过点杂交法,用标记的探针检测上述样品的灵敏度。结果高盐抽提法提取的CHO细胞DNA效果较好;体系4(DNA10μg,Vial416μl,总体积64μl)标记效率最高;经不同方法处理的1、2、3组CHO细胞DNA内部参考品的检测灵敏度分别为1pg、10pg和1ng。结论建立的地高辛标记CHO细胞DNA探针-点杂交检测CHO细胞DNA残留量的方法稳定可靠,可用于生物制品中CHO宿主细胞DNA残留量的检测。     

胶体金探针的研制及在T细胞亚群检测中的应用

采用鞣酸—柠檬酸钠还原法制备了不同颗粒大小（如φ6nm、φ10nm、φ15nm）、不同种类的胶体金标记抗小鼠IgG、抗人IgG及SPA等探针。所制备的胶体企探针直径达到标记要求，颗粒大小均匀，稳定性好。用该探针检测健康人外周血淋巴细胞表面抗原，如CD3、CD4和CD8等T-淋巴细胞亚类抗原，其本底低，对比度好，阴阳性分明，优于常规的免疫荧光法。     

重组人肠道病毒71型病毒样颗粒疫苗外源DNA残留量检测方法的建立

目的建立重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗原液中昆虫细胞宿主DNA残留的地高辛探针杂交检测方法。方法抽提昆虫细胞sf9基因组DNA,经分子筛纯化后作为阳性对照品;分别以1 000~5 000 bp和100~1 000 bp的基因组DNA超声随机小片段为模板,制备地高辛探针,与阳性对照进行杂交试验。同时验证方法的检测范围、灵敏度和特异性,并采用该方法对3批重组EV71 VLPs疫苗原液中宿主DNA残留量进行测定。结果纯化后DNA样品浓度为47. 5 ng/μL,A260/A280值为1. 86,可作为阳性对照。以100~1 000 bp DNA超声随机小片段作为模板,探针标记效率更高,杂交显色更清晰。该法检测范围为10 pg^10 ng,灵敏度达1 pg,特异性强。3批重组EV71 VLPs疫苗原液中每人份剂量的宿主细胞DNA残留均<50 pg。结论本实验建立的方法特异性强,灵敏度高,可用于重组EV71 VLPs疫苗制备过程中的原液检定及质量控制。     

DNA功能化金纳米颗粒在沙眼衣原体检测中的应用

目的建立一种基于DNA功能化金纳米颗粒检测沙眼衣原体的新方法。方法分析沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)Trp B保守基因序列,设计2条特异性寡核苷酸链,一条进行巯基修饰后与柠檬酸钠还原法制备的金纳米颗粒结合得到信号探针,另一条用生物素标记作为捕获探针。制备的靶序列与两种探针在包被链霉亲和素的酶标板内形成牢固的带有金纳米颗粒的核酸复合物,加入银染液后,经酶标仪读取630 nm处A值或肉眼观察96孔板底灰度。对建立的检测体系进行特异性和灵敏度验证。用建立的检测体系及荧光定量PCR法对可疑临床沙眼衣原体样本进行检测。结果制备的金纳米颗粒经透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察确定其粒径约20 nm,吸收峰为518 nm,金纳米颗粒标记的信号探针吸收峰为520 nm;不同靶序列浓度的银染结果可用肉眼进行分辨。优化后的检测体系为:反应时间2 h,杂交温度25℃,生物素探针浓度100 nmol/L,银染色时间8 min。建立的方法能特异性检测沙眼衣原体核酸序列,与其他生殖道病原菌无交叉反应,最低检测浓度达55 pmol/L。49份临床样本检出率为61%,与荧光定量PCR法相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论建立了一种简便、高效、特异的沙眼衣原体检测方法,成本低廉,为沙眼衣原体的临床病原学诊断提供了新的途径。     

用硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙型脑炎疫苗中残余DNA

通过试验研究建立一种去除Vero细胞乙脑疫苗中残余细胞DNA的方法，即疫苗经超滤浓缩后加入0.8～1.0mg／ml的硫酸色精蛋白，于4℃静置2h，8000r／min离心5min。DNA与鱼精蛋白共同沉于管底。用该法处理的疫苗不仅使残余DNA达到规程要求（＜100pg／剂量），而且抗原活性无明显丢失。     

阈值法检测人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量方法的建立及初步验证

目的建立一种阈值法(threshold method)检测人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量的方法。方法取人用狂犬病疫苗进行DNA抽提后,与内控品经高温变性、冰浴后,37℃水浴1 h,加入生物素标记的单链DNA结合蛋白(single stranded binding protein,SSB)和尿素酶标记的抗单链DNA(single stranded DNA,ssDNA)的单抗,与变性的宿主细胞DNA结合形成复合物,经过滤、洗涤后,将复合物吸附于硝酸纤维素膜上,置Threshold仪器样品检测池中,检测DNA含量。对建立的阈值法测定人用狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量的方法进行线性范围、准确性及精密度验证。结果该方法的最低检测限为3 pg/500μl,线性范围为3~200 pg/500μl,DNA内控品浓度的对数与相应的检测信号值的对数呈良好的线性关系(R2=0.98);该方法检测不同企业疫苗样品的回收率为99%~124%,变异系数为8.5%,加入内控品后再抽提,不同企业疫苗样品的回收率为48%~128%,变异系数为32.9%;同1批疫苗重复10次的检测结果的CV值为7.8%,同1批疫苗不同时间检测结果的CV值为11.8%。结论阈值法可检测人用狂犬病疫苗Vero细胞宿主DNA残留量,该方法操作简便,灵敏度好,准确性及精密度高,对人用狂犬病疫苗生产和质量控制具有较好的指导意义。     

五种编码流感病毒蛋白的DNA疫苗的免疫原性研究

目的 比较编码流感病毒A/PR/8/34（H1N1）蛋白的各类DNA疫苗在BALB/c 小鼠的免疫原性。方法 分别将编码流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、基质蛋白（matrix protein，M1）、核蛋白（nucleoprotein，NP）以及非结构蛋白（nonstructural protein，NSI）基因克隆入表达质粒。用基因枪轰击法将构建的重组DNA转入小鼠表皮，共2次，间隔3周。第2次免疫7d后，用同源病毒攻击小鼠，通过检测小鼠肺部病毒量和小鼠存活率来评价上述各类DNA对小鼠的免疫原性。结果HA、NA　DNA能诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体，并提供有效的保护。而 M1、NP、NS1 DNA不能提供有效的保护，尽管其中用 M1、NP DNA免疫的小鼠能检测到抗体应答。结论 病毒表面糖蛋白HA、NA DNA具有较强的免疫原性。     

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果 DNA标准品浓度为3～200 pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10. 812 x-36. 761,R2=0. 994 5;加入100和25 pg DNA标准品的样品回收率为88%～110%,CV分别为7. 7%和7. 4%;精密度各次检测CV均10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181. 9、104. 2和64. 6 pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和100 pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。     

基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制

目的建立基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定。方法采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA。纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量。结果经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA。获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5%;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9%(P<0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg。结论建立了基因治疗用pUC118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础。     

多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗中Vero细胞残留DNA

目的采用多种方法结合去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞残留DNA。方法采用滤芯(滤板)澄清、鱼精蛋白处理、核酸酶处理、Sepharose 4FF层析纯化或澄清、核酸酶、Sepharose 4FF层析纯化结合的方法去除Vero细胞培养的狂犬病病毒液中的Vero细胞DNA,检测Vero细胞DNA残留量、抗原含量、核酸酶残留量及疫苗效价。结果 0.45μm UB玻璃纤维澄清病毒液,抗原损失率较小;鱼精蛋白去除Vero细胞DNA,抗原损失量较大;核酸酶处理后,病毒液中Vero细胞DNA残留量仍高于1 ng/ml;经Sepharose 4FF层析纯化,能有效去除浓缩后经核酸酶处理的病毒液中的核酸酶及一定量的Vero细胞DNA;采用多种方法结合去除病毒液中Vero细胞残留DNA,DNA残留量<100 pg/ml,疫苗效价≥4.0 IU/ml,均达到《中国药典》三部(2010版)要求。结论多种方法结合能有效去除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量,且疫苗效力达到《中国药典》三部(2010版)要求。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒基因探针的制备及应用

本文从克隆化的HSV-1 EcoRI-H片段重组菌株中分离重组质粒DNA。经酶切、低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出目的基因HSV-1 EcoRI-H片段DNA(13.5Kb)。用缺口翻译法制备a-~(32)P标记探针。通过斑点杂交试验检测10例临床样品及阳阴性对照病毒标准株。结果表明,该探针只与单纯疱疹病毒DNA杂交,而不与腺病毒Ⅲ型(Ad_3)、痘苗病毒(VV)、Vero细胞DNA杂交。且可检测出至少5pg的同源序列DNA。表明该探针具有良好的特异性和敏感性。检测的10例临床标本有两例出现阳性,与病毒分离培养结果一致。     

单晶硅上电沉积Cu/Co纳米多层膜及其巨磁电阻效应

采用双脉冲控电位技术在单晶硅上沉积了一系列Cu/Co纳米多层膜,调制波长从200nm到5nm不等.用扫描电镜及X射线衍射对多层膜的调制结构进行了表征.采用四探针法测试多层膜的巨磁电阻（GMR）效应,研究了GMR与调制波长（λ）、铜的子层厚度（δ_Cu）的关系：λ较大时,没有观察到明显的GMR效应;λ＜30nm时,GMR效应随λ减小而增大;而λ＜8nm时,GMR值随铜层厚度的变化周期性振荡.     

抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体的研制及初步应用

用8－AG（8－氮杂鸟嘌呤）驯化的HRP－MCAb（抗辣根过氧化物酶单克隆抗体）杂交瘤细胞HAT（次黄嘌呤氨基喋呤胸苷）敏感株与人IgG免疫的BALB／c小鼠脾细胞进行二次融合，获得5株能稳定分泌抗人IgG－抗HRP的BsMcAb（双特异性单克隆抗体）杂交－杂交癌细胞，用其混合腹水经HRP亲和层析纯化的BsMcAb制备BsMcAbPAP（双特异性单抗过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物）试剂代替丙肝诊断试剂盒中酶标二抗，比较结果初步表明两者差异无显著意义，将为IgG的检测提供有用试剂。     

菌紫质LB膜对闪光的响应

菌紫质ＬＢ膜对闪光的响应张志广杨俭华王光毓张光年林书煌（首都师范大学生物信息科学研究所，北京１０００３７）卢涛李宝芳江龙（中国科学院感光化学研究所，北京１００１０１）关键词ｂＲＬＢ膜，闪光，临界闪光融合频率光敏生物大分子菌紫质（ｂＲ）是嗜盐菌...     

纤维素酯膜的有机物渗透性

本文研究了经丙酮水溶液改性处理后的醋酸纤维素（CA）反渗透（RO）膜的有机物渗透性，在丙酮改性处理过程，透过CA－RO膜的丙酮溶剂量，开始时迅速下降，然后逐渐趋于零，多孔膜变成了致密均相膜，非对称性的超滤（UF）膜，纳滤（NF）膜，RO膜，分别经丙酮改性处理后，甲苯透过膜的渗透速率依次减少。孔径越小，脱盐率越低的RO膜，经改性处理后，甲苯渗透速率越小，三醋酸纤维素（CTA）与醋酸丁酸纤维素（CAB）二组分混的CTACAB膜，或者与醋酸丙酸纤维素（CAP）三组分共混的CTACABCAP膜，随着实验时间的延长，甲苯的渗透速率，前者逐渐下降到接近零时趋于稳定，后者没有变化，改性的CA膜和CTACAB共混膜分离甲基叔丁基醚（MTBE）／甲醇（MeOH)混合物时，渗透能量分别为835和226（g/m^2.h)，渗透物中MeOH浓度都达到88wt％。