低温保护剂添加与去除过程对猪卵母细胞的渗透损伤

在卵母细胞低温保存过程中,低温保护剂的添加与去除是必不可少的步骤,但此过程会对细胞造成致命的渗透损伤和毒性损伤。为了研究保护剂添加和去除联合过程对猪MII期细胞的损伤程度,本文设计并制作了一个适合卵母细胞低温保护剂连续添加与去除的微流体装置,分别采用微流控线性法和传统的分步法加载和去除低温保护剂,分析了两种方法对卵母细胞的体积变化以及存活率与发育潜能的影响。结果表明:微流控线性法加载和去除低温保护剂时,卵母细胞的体积变化明显小于分步法;线性法处理后细胞的存活率、卵裂率、囊胚率分别为95.3%、64.4%、19.4%,都显著高于传统的分步法(79.4%、43.6%、9.7%)(P0.05)。因此,微流体装置用于卵母细胞低温保护剂添加与去除是有效的,能够显著减小细胞的渗透损伤,为卵母细胞低温保存技术提供了新思路。     

纳米低温保护剂提高卵母细胞玻璃化保存效果的机理初探

纳米颗粒添加到低温保护剂中可能是未来低温保存的重要手段。采用添加了羟基磷灰石(HA)纳米颗粒的低温保护剂冷冻卵母细胞,使用低温显微镜观察了结晶、再结晶和融化时冰晶的形态和细胞的变化,同时记录各现象发生的温度。发现添加0.05%HA组在升温过程中再结晶不明显,且再结晶危险区较小,对细胞无损伤;而未添加HA组细胞在复温过程中受伤几率很高。结果表明纳米颗粒减少了复温过程中的再结晶可能是纳米低温保护剂提高细胞存活率的主要机理之一。     

微滴喷射玻璃化的过程损伤分析及保护剂优化

微滴喷射玻璃化保存系统产生的微滴尺寸较小,在较低浓度的低温保护剂条件下即可实现玻璃化。本文采用微滴喷射玻璃化保存系统对HepG2细胞进行玻璃化保存,研究保护剂加载过程、喷射过程、接收过程及玻璃化/复温过程对细胞造成的损伤程度,并通过降低保护剂中Me2SO浓度、添加适量海藻糖来优化保护剂配方。结果表明,微滴喷射玻璃化保存各过程对细胞均有损伤,保护剂加载过程、喷射过程、玻璃化及复温过程对细胞造成的损伤较大,薄片接收过程对细胞造成的损伤小。另外,随着保护剂中Me2SO浓度的降低,低温保存后的细胞活性明显降低;保护剂浓度相同时,玻璃化保存效果较慢速冷冻效果好;适量的海藻糖能够起到增强低温保存效果的作用,过量则起到降低作用;以5%Me2SO+0.3 mol/L海藻糖作为低温保护剂玻璃化保存细胞时,细胞存活率达(92.42±0.95)%,24 h贴壁率达到(95.64±1.03)%,微滴喷射玻璃化效果最好。     

可视化DSC新设备及其在低温冻存研究领域的应用

研制了一套具有可视化功能的差示扫描量热法实验装置(简称可视化DSC),它能在热分析的同时,通过配套使用的显微摄像系统实时观察并记录测试样品的微观结构变化,以同时获得测试样品的热效应数据和微观结构图像数据.利用可视化DSC对低温保护剂1,2-丙二醇和聚乙烯醇(PVA)溶液进行冻结实验,考察PVA对低温保护剂溶液冻结特性的影响,结果表明,在1,2-丙二醇溶液中添加PVA能有效抑制冰晶成核和生长;选择PVA作为冻存液添加剂,利用可视化DSC对脐带血间充质干细胞(MSCs)进行程序冷冻-解冻实验,考察PVA在MSCs低温冻存中的实际效果,结果表明,在冻存液中添加PVA,有助于抑制冰晶形成,降低细胞冷冻损伤,提高细胞在程序慢速冷冻-解冻后的存活率.     

基于蚕丝蛋白的低温保护剂用于梅山猪耳成纤维细胞的低温保存研究

细胞低温保存为临床治疗和科学研究提供优质的细胞。体积分数为10%二甲基亚砜(DMSO)和体积分数为20%胎牛血清(FBS)是目前冻存细胞常用的保护剂。但DMSO对细胞具有毒性损伤,FBS存在携带病毒、感染疾病的风险。本文以梅山猪耳成纤维细胞作为模型细胞进行冻存实验,将蚕丝蛋白用于低温保护剂中,用不同质量浓度的丝胶蛋白和不同体积分数的丝素蛋白来分别替代FBS和DMSO,验证其在细胞低温保存中的有效性。解冻复苏后用台盼蓝染色法、MTT法、24 h贴壁率等检测细胞的存活率和生长活力,筛选出最佳的基于天然蚕丝蛋白的低温保护剂配方。结果表明:含质量浓度为1%丝胶蛋白和含体积分数为20%FBS的低温保护剂对猪耳细胞的冻存效果无显著差异,说明丝胶蛋白能有效替代FBS。将体积分数为10%DMSO浓度降至5%,添加体积分数为10%丝素蛋白后,细胞的存活率和贴壁率与对照组相比无明显差异,说明丝素蛋白能降低DMSO的浓度。将质量浓度为1%丝胶蛋白与体积分数为10%丝素蛋白联用后,能达到较好的冻存效果。     

人肝癌细胞Hep-G2的低温保存研究

在细胞的低温保存中,低温保护剂的种类与浓度对复温后的存活率有着重要影响。本文以人肝癌细胞Hep-G2为研究对象,利用慢速冷冻法,筛选最佳的冻存液配方。通过配比不同浓度的甘油、Me2SO以及在Me2SO中添加一定浓度的蔗糖、海藻糖,一周后复温细胞,对台盼蓝染色存活率、MTT存活率以及24 h贴壁率三种检测结果进行比较分析,结果表明:以Me2SO作为低温保护剂时,冻存液浓度为10%(v/v)的Me2SO复温后细胞的三种检测指标最优;以甘油作为低温保护剂时,冻存液浓度为20%(v/v)的甘油复温后细胞的三种检测指标最优;再将以上分别得到的最佳浓度(即体积浓度20%甘油、10%Me2SO)与5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L蔗糖、5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L海藻糖这四种低温保护剂进行冻存与比较,5%Me2SO(v/v)+0.3mol/L海藻糖检测指标高于其他实验组,并且差异显著(P0.05)。最终得到5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L海藻糖为慢速冷冻保存Hep-G2细胞的最优保护剂配方。     

低温保护剂热物性分析与冰晶的显微研究

低温保存过程中,冰晶的形成和生长是造成细胞损伤的主要因素之一。本文研究低温保护剂在降温过程中冰晶的生长规律,方法是应用低温显微镜系统,观察低温保护剂溶液的浓度及不同添加物对于冰晶生长和形状的影响,并利用差示扫描量热法(DSC)研究了溶液的熔融相变过程的变化。低温显微实验表明:低温保护剂溶液结晶形状、大小与溶液的浓度和添加溶质(糖或糖醇)有关,溶液浓度高,形成的冰晶小,对细胞损伤小,添加山梨醇的混合液冰晶形状细小,减轻了冰晶对细胞结构的物理损伤。DSC实验表明:在四种低温保护剂中5%Me2SO与山梨醇混合液(体积比)熔融温度最低,热焓值最小,溶液形成的冰晶最少,因此对细胞的低温损伤最轻。     

糖醇类物质对人肝细胞低温保存的影响

将传统肝细胞冻存保护剂配方中的DMSO的浓度减为5%,并添加不同浓度的D-山梨醇、木糖醇或麦芽糖醇,置于-80℃的冰箱冻存两周,两周后将细胞快速复温,进行细胞存活率、24h贴壁率以及细胞形态学的检测,并与10%浓度DMSO组对照比较。结果表明,D-山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇均对人肝细胞的低温保存有一定的保护作用,其中5%DMSO+0.4M D-山梨醇组复温后细胞的存活率、贴壁率均优于其他冻存液组,D-山梨醇与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用。     

交变电场对鸡血红细胞悬液低温保存特性的影响

以鸡血红细胞悬液为研究模型,通过在对其进行慢速冻结的过程中引入交变电场,研究了交变电场对鸡血红细胞冻结特性的影响。结果表明在1 MHz交变电场作用下,经历了冷冻速率为5℃/min的慢速冷冻后部分红细胞没有出现细胞膜破裂现象,细胞保持了完整的形态,细胞存活率为23.4%±1.43%,比对照组明显提高;但同使用质量分数为3.3%的低温保护剂(二甲基亚砜)的保存效果(37.2%±2.81%)相比还较差。可见将交变电场应用于生物材料低温保存是一种新颖有效的低温保存技术,但还是需要进一步研究最佳电场条件以提高低温保存效率。     

微液滴自然蒸发加载低温保护剂的细胞渗透特性与损伤评估

本文提出了一种微液滴自然蒸发加载低温保护剂的方法，借助图像处理技术，结合细胞渗透模型与损伤模型进行理论分析，系统研究了初始体积和初始浓度对微液滴自然蒸发加载低温保护剂过程的细胞渗透特性与损伤的影响，并与传统低温保护剂加载方法(一步加载、两步加载)进行对比。研究结果表明：微液滴的初始体积越小，蒸发速率越快，低温保护剂更易达到目标浓度，能够有效缩短加载时间(1μL相比5μL缩短4 907 s);随着低温保护剂初始浓度的降低，加载时间逐渐增长(0.5 M和2.5 M分别为2 460、1 346 s),但造成的细胞体积变化极值显著减小(0.5 M和2.5 M分别为初始体积的14%和43%),累积毒性损伤也会显著降低(0.5 M和2.5 M分别为23.05、47.53);微液滴自然蒸发加载相比传统加载方法可显著提高细胞存活率与细胞增殖能力(P<0.05),其细胞存活率为96.73%±0.54%,比一步加载提升16%,且培养48 h的细胞贴壁情况显著优于两步加载。表明该新方法能够简化低温保护剂加载流程，并能有效降低细胞损伤。     

Cellular cryobiology: thermodynamic and mechanical effects

Several physical stresses kill cells at low temperatures. Intracellular ice is usually fatal, so survival of freezing temperatures involves combinations of dehydration, freezing point depression, supercooling and intracellular vitrification. Artificial cryopreservation achieves intracellular vitrification with rapid cooling, modest osmotic contraction and, often, added cryoprotectants. High warming rates are required to avoid crystallization during warming. Environmental cooling is much slower and temperatures less cold, but environmental freezing damage is important ecologically and agronomically. For modest sub-freezing temperatures, supercooling sometimes allows survival. At lower temperatures, extracellular water usually freezes and cells may suffer large osmotic contractions. This contraction concentrates solutes and thus assists vitrification, but is not necessarily reversible: the rapid osmotic expansion during thawing may rupture membranes. Further, membranes and other ultrastructural elements may be damaged by the large, anisotropic mechanical stresses produced when their surfaces interact via hydration forces. Solutes reduce these stresses by osmotic, volumetric and other effects.     

新型低温保存装置性能的实验研究

低温保存装置是实现生物材料长期储存的关键设备之一.采用自复叠制冷、自动化控制和最新低温生物技术的冻结线跟踪法开发了一种新型低温保存装置.利用该装置对甘油、丙二醇、二甲亚砜这三种常用的低温保护剂溶液进行了程序控制的变浓度降温和复温实验,使溶液的最终浓度达到玻璃化所需的浓度,最低温度降到-80℃以下.实验表明,新装置性能符合低温保存要求,在生物材料的玻璃化保存领域有良好的应用前景.     

成纤维细胞玻璃化保存的初步实验研究

成纤维细胞是构建组织工程化真皮的种子细胞,实现成纤维细胞的低温保存对成功保存组织工程化真皮有着重要的意义.采用不同组成及浓度的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化低温保存实验,并考虑了离心次数对细胞存活率的影响.实验结果表明:玻璃化溶液的组成、浓度及复温后的离心次数等因素对细胞的存活率均有明显的影响.在实验条件下,采用组分配比为5.4 mol/LEG 1.4 mol/L DMSO的玻璃化溶液对成纤维细胞进行玻璃化保存,复温后以1000r/min的转速离心1次(5 min)后,再以800r/min的转速离心4次(每次4 min),可获得较高的细胞存活率,其值为87.1%.     

Cryoprotection of Emulsions in Freeze-Drying: Freezing Process Analysis

We report the effects of different freeze/thawing processes on oil-in-water emulsions. The influence of the oil phase concentration, the cooling rate and the addition of carbohydrates as cryoprotectors were investigated. It appears that a slow cooling rate and the addition of cryoprotectants which do not crystallize during freeze/thawing have the best stabilizing effects. These stabilizing effects were attributed to the amorphous state of the cryoprotectants and the lower mechanical stress due to the slow cooling rate. Heat treatment before thawing causes crystallization and decreases the stabilizing effects.

These results show the importance of crystalline state of additives used as cryoprotectants during freeze/thawing.     

Cryoprotection of Emulsions in Freeze-Drying: Freezing Process Analysis

Abstract

We report the effects of different freeze/thawing processes on oil-in-water emulsions. The influence of the oil phase concentration, the cooling rate and the addition of carbohydrates as cryoprotectors were investigated. It appears that a slow cooling rate and the addition of cryoprotectants which do not crystallize during freeze/thawing have the best stabilizing effects. These stabilizing effects were attributed to the amorphous state of the cryoprotectants and the lower mechanical stress due to the slow cooling rate. Heat treatment before thawing causes crystallization and decreases the stabilizing effects.

These results show the importance of crystalline state of additives used as cryoprotectants during freeze/thawing.     

最小体积法玻璃化保存的研究进展

在低温保存领域,玻璃化能有效防止冰晶的形成,具有良好的保存效果。玻璃化保存需要的条件是极快的降温速率和高浓度的低温保护剂,但高浓度低温保护剂会对细胞造成渗透损伤和毒性损伤。最小体积法能通过减小样本体积,大大提高降温速率,降低实现玻璃化所需的保护剂浓度。本文综述了最小体积法玻璃化保存的最新研究进展,包括有载体的微滴玻璃化保存、喷射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存和微流体封装微滴玻璃化保存。其中,喷射微滴玻璃化保存、生物打印微滴玻璃化保存及微流体封装微滴玻璃化保存,是将新型的微滴产生技术与玻璃化技术相结合,因其能迅速产生大小均匀的微滴,具有高通量特点,在低温保存领域具有很大的发展潜力。     

The effect of glass-forming sugars on vesicle morphology and water distribution during drying

Cryopreservation requires that stored materials be kept at extremely low temperatures and uses cryoprotectants that are toxic to cells at high concentrations. Lyopreservation is a potential alternative where stored materials can remain at room temperatures. That storage process involves desiccating cells filled with special glass-forming sugars. However, current desiccation techniques fail to produce viable cells, and researchers suspect that incomplete vitrification of the cells is to blame. To explore this hypothesis, a cell is modelled as a lipid vesicle to monitor the water content and membrane deformation during desiccation. The vesicle is represented as a moving, bending-resistant, inextensible interface and is tracked by a level set method. The vesicle is placed in a fluid containing a spatially varying sugar concentration field. The glass-forming nature is modelled through a concentration-dependent diffusivity and viscosity. It is found that there are optimal regimes for the values of the osmotic flow parameter and of the concentration dependence of the diffusivity to limit water trapping in the vesicle. Furthermore, it is found that the concentration dependencies of the diffusivity and viscosity can have profound effects on membrane deformations, which may have significant implications for vesicle damage during the desiccation process.