水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位研究

[目的]探讨水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位.[方法]克隆了水稻中的重要通道蛋白OsPIP2-6基因,构建了瞬时表达载体,通过基因枪法在洋葱表皮中进行瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜进行了观察.[结果]水稻水通道蛋白OsPIP2-6主要定位在细胞质膜上,证明了OsPIP2-6是个水通道蛋白.[结论]为植物水通道蛋白的深入研究提供了理论依据.     

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx 蛋白在293T 细胞中的表达并检测其抗病毒活性.[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1栽体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T 细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性.[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达栽体转染293T 细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot 结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染.[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx 表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx 蛋白.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C(LDH-C)基因的原核表达及重组蛋白的纯化.[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化.[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白.[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达.     

水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOlel.[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOlel,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOlel-GST,在大肠杆菌B121中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化.[结果]水稻蛋白OsOlel具有典型的Oleel蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肤序列.成功地将水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化.[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOlel的生理功能奠定了基础.     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础.[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白(RFP)基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况.[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞(80.56%)相比无显著差异(P>0.05);RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组(6.56%)相比无显差异著(P>0.05);RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体.[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚.     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达.[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.Coll BL21(DE3)进行蛋白质表达.[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.Coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白.[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础.     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-PAV,MP)形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系.[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体.电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象.[结果]农杆菌渗透注射后,2～5 d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象.[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了依据.     

穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及表达

[目的]克隆并表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因.[方法]将穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体 pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因.[结果]重组酵母菌在0.5%甲醇中培养144 h后,所提取的酶蛋白具有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性,经SDS-PAGE 分析,确定其相对分子质量为58 kD.[结论]穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因得到了表达.     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达.[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19 )核酸序列设计1 对引物,用RT-PCR 扩增出分离CAS19 的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒 PBCAS.经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗.[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达.[结论]为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据.     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因.[方法]对应用抑制差减杂交枝术(SSH)获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测.[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性.[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用.