水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOlel.[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOlel,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOlel-GST,在大肠杆菌B121中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化.[结果]水稻蛋白OsOlel具有典型的Oleel蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肤序列.成功地将水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化.[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOlel的生理功能奠定了基础.     

水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位研究

[目的]探讨水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位.[方法]克隆了水稻中的重要通道蛋白OsPIP2-6基因,构建了瞬时表达载体,通过基因枪法在洋葱表皮中进行瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜进行了观察.[结果]水稻水通道蛋白OsPIP2-6主要定位在细胞质膜上,证明了OsPIP2-6是个水通道蛋白.[结论]为植物水通道蛋白的深入研究提供了理论依据.     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilaA基因.[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析;合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21(DE3)中,进行SDS-PAGE与Western blot检测.[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致.[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础.     

犬IL-2基因克隆及原核表达

[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强荆和基因工程疫苗提供理论支持.[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank 中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌B121中,经IPTG 诱导表达.表达产物用SDS-PAGE进行分析.[结果]RT-PCR 扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2 经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2 经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE 分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同.[结论]IL-2基因被成功克隆和表达.     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达.[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.Coll BL21(DE3)进行蛋白质表达.[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.Coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白.[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础.     

小麦NBS类序列的分离与特征分析

[目的]获得小麦近等基因系TcLr24中NBS类抗病基因同源序列.[方法]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构"P-loop"和"GLPL"合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增.[结果]得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物序列,包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构,相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.1%～98.3%,同时对分离的RGAs的氨基酸序列和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行聚类分析表明,与Xal、RPS2亲缘关系较近,而与Lr21亲缘关系较远.[结论]TcLr24中NBS类RGAs可能会有与Lr21不同机制的抗病功能.     

四川地区水稻纹枯病菌及其致病力研究

[目的]研究四川地区水稻纹枯病菌的培养性状及其致病力.[方法]对从四川地区6个水稻主栽点采集的水稻纹桔病样进行分离,将分离所得病菌用PDA培养基培养,记录其培养性状,并对分离得到的23个菌株进行致病力测定.[结果]不同菌株间的生长速率存在显著差异,23个菌株中只有1个菌株生长速率属于中等菌株(40 mm≤Φ≤60 mm),其余都为慢型菌株(Φ<40 mm),无生长速率快的菌株(Φ>60 mm).致病力测定结果表明, 菌株间致病力存在明显的差异,23个菌株中只有1个为强致病力菌株,其余为中等致病力茵株、无弱致病力菌株.[结论]该研究明确了四川地区水稻纹枯病病菌基本生物学特征,为该地区有效控制水稻纹枯病的危害提供了理论依据.     

抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因

[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因.[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因.[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好.选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签(ESTs).对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因.[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高.该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础.     

水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位.[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pA7-YFP表达载体,通过基因枪将融合载体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位.[结果]OSST蛋白定位于细胞膜和核膜上.[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础.     

新疆阿拉尔垦区猪嗜血支原体PCR检测方法的建立

[目的]掌握阿拉尔垦区猪嗜血支原体的流行现状.[方法]根据GenBank上发表的猪嗜血支原体16S rRNA基因组序列(U88565)设计1对特异性引物,对采自新疆阿拉尔垦区的样品进行PCR扩增,并将其产物克隆到pBR322载体后测序.[结果]扩增出的片段为0.836 kb.同源性分析结果表明,该序列与猪嗜血支原体参考基因组序列同源性为99.47%,反映出我国分离株与国外株基因同源性较高.[结论]建立了一种猪嗜血支原体PCR检测方法,该方法为猪嗜血支原体病的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段,并为相关基因的表达及功能研究奠定了基础.     

牛整合素β6基因的原核表达及其抗血清的制备研究

[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础.[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因(ITGB6)胞外区,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IFTG诱导及蛋白纯化.[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1:2560.[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C(LDH-C)基因的原核表达及重组蛋白的纯化.[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化.[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白.[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达.     

穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因的亚克隆及表达

[目的]克隆并表达穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因.[方法]将穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因亚克隆到毕赤酵母表达载体 pPIC9K,再将构建后的表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,并诱导表达该基因.[结果]重组酵母菌在0.5%甲醇中培养144 h后,所提取的酶蛋白具有穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶的活性,经SDS-PAGE 分析,确定其相对分子质量为58 kD.[结论]穿山龙薯蓣皂苷糖苷酶基因得到了表达.     

拮抗真菌菌株BOS-013对稻瘟病菌的抑制作用

[目的]为寻找对水稻稻瘟病的有防治作用的有益微生物及其代谢产物,研究放线菌BOS-013菌株发酵液对水稻稻瘟病菌的抑制作用.[方法]以水稻稻瘟病菌作为目标指示菌,采用杯碟法和滤纸片法测定BOS-13菌株发酵液及其不同溶剂提取物的抑菌活性.[结果]研究结果表明,含菌量为4×10<'8>cfu/ml的BOS-13菌株发酵液对水稻稻瘟病菌的抑制率为92.O%±0.5%;该发酵液经高温、高压灭活后对水稻稻瘟病菌仍有抑制作用,抑制率为60.0%±0.5%.发酵液经非极性CAD-5型大孔吸附树脂吸附、60%乙醇溶液洗脱后,其抑菌活性很高,抑菌圈直径达33.0 mm.[结论]BOS-13菌株发酵液水稻稻瘟病菌有显著的抑制作用;该研究结果为进一步明确BOS-13菌株发酵液时水稻稻瘟病菌的抑制作用机理及其实际应用奠定了基础.     

家蚕TPR基因的克隆

[目的]克隆家蚕TPR基因,为研究该基因功能提供依据.[方法]利用Trizol法提取家蚕蛹期总RNA,再用RT-PCR方法对家蚕TPR基因进行克隆.[结果]成功得到家蚕TPR基因全cDNA序列,并用PCR扩增得到了TPR基因的ORF,全长858 bp.[结论]首次对家蚕TPR家族基因进行了克隆,为今后对该基因功能研究奠定了坚实的基础.     

转基因水稻外源基因向稗草的漂移研究

[目的]研究转基因水稻中外源基因向同科杂草稗草的基因漂移情况.[方法]利用农杆菌介导的方法,获得稳定遗传的转hpt基因水稻株系,对转基因水稻田中自然生长和人工种植的稗草种子进行PCR检测,确定是否含有转基因成分.[结果]通过对多株杂草稗种子获得的22000株幼苗的PCR检测,均未能检测到外源基因的存在.[结论]未发现稳定遗传的转基因水稻中外源基因向稗草的漂移.     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达.[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19 )核酸序列设计1 对引物,用RT-PCR 扩增出分离CAS19 的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒 PBCAS.经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗.[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达.[结论]为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据.     

传染性法氏囊病病毒VP5蛋白跨膜区的敲除及可溶性原核表达研究

[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化.[方法]利用PCR技术分别扩增IBDV VP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b+)同时相接,即载体-胞内片段-胞外片段-载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET-VP5-FC及改进后的pET-VP5-SC.将表达质粒转化B121(DE3),IPTI;诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白.[结果]得到可溶性表达的IBDV VPS.[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础.     

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β(IL-1β)全长 cDNA 的克隆、鉴定及其差异表达分析.[方法]利用 DD-RTPCR 方法获得差异表达 cDNA 片段,时有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞 cDNA 文库进行筛选,克隆了鲤鱼 IL-1β的全长 cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析.[结果]获得的阳性克隆含有 1 个大小为 831 bp 编码 276 个氨基酸的完整开放阅读框.聚类分析表明,鲤鱼 IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达 95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠.差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期(4 h)白细胞中 IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移(12,24 h)并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形.[结论]为进一步研究 IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础.     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析

[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析.[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序.[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1 252和908 bp.rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525 bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448 和107 bp.[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础.