水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位.[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pA7-YFP表达载体,通过基因枪将融合载体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位.[结果]OSST蛋白定位于细胞膜和核膜上.[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础.     

水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中的诱导表达

[目的]在大肠杆菌中诱导表达水稻蛋白OsOlel.[方法]RT-PCR克隆水稻基因OsOlel,构建原核表达载体pGEX-2T-OsOlel-GST,在大肠杆菌B121中诱导表达该蛋白,并采用GST凝胶亲和层析进行纯化.[结果]水稻蛋白OsOlel具有典型的Oleel蛋白家族的保守域,N端1～24位氨基酸为预测的信号肤序列.成功地将水稻蛋白OsOlel在大肠杆菌中进行了诱导表达,并用GST亲和层析进行了纯化.[结论]该研究为以后进一步研究水稻蛋白OsOlel的生理功能奠定了基础.     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因.[方法]对应用抑制差减杂交枝术(SSH)获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测.[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性.[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用.     

传染性法氏囊病病毒VP5蛋白跨膜区的敲除及可溶性原核表达研究

[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化.[方法]利用PCR技术分别扩增IBDV VP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b+)同时相接,即载体-胞内片段-胞外片段-载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET-VP5-FC及改进后的pET-VP5-SC.将表达质粒转化B121(DE3),IPTI;诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白.[结果]得到可溶性表达的IBDV VPS.[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础.     

牛整合素β6基因的原核表达及其抗血清的制备研究

[目的]为深入研究ITGB6亚基的基因功能奠定基础.[方法]利用基因克隆技术获得整合素β6基因(ITGB6)胞外区,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,经鉴定及序列分析确定获得了重组阳性克隆;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IFTG诱导及蛋白纯化.[结果]SDS-PAGE结果显示,在94 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备ITGB6蛋白抗血清,Western-blot分析表明抗血清可与原核表达的ITGB6蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1:2560.[结论]成功表达了牛的重组整合素β6基因.     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达.[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19 )核酸序列设计1 对引物,用RT-PCR 扩增出分离CAS19 的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒 PBCAS.经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗.[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达.[结论]为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据.     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达.[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.Coll BL21(DE3)进行蛋白质表达.[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.Coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白.[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础.     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C(LDH-C)基因的原核表达及重组蛋白的纯化.[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化.[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白.[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达.     

微针注射甜玉米胚芽gus基因转化瞬时表达研究

[目的]研究微针注射甜玉米(Zea mays L.)胚芽gus基因转化瞬时表达,为玉米遗传转化的进一步研究奠定基础.[方法]以农杆菌为介导,采用gus基因瞬时表达技术,建立了胚芽注射开放性基因转化体系.[结果]3 mm长的胚芽为最适转化受体;农杆菌EHA105菌液浓度最适OD值为0.558～0.630;gus基因转化最适共培养天数为3 d.在以上最适转化条件下,微针注射胚芽生长点基因转化率为1%.[结论]该研究可为改良甜玉米遗传性状,培育基因工程新品种提供参考.     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilaA基因.[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析;合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21(DE3)中,进行SDS-PAGE与Western blot检测.[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致.[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础.