纤维素直接发酵乙醇微生物的选育──Ⅲ.里氏木霉与运动发酵单胞原生质体融合的研究

用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂，可使钝化的里氏木霉（Tri－chodermareesei）QM9414的原生质体和运动发酵单胞（Zymomonasmobilis）ATCC29191的原生质球之间可以产生远缘的细胞融合子。融合率可达1．9×10－2融合子能利用羧甲基纤维素为唯一碳源而产生羧甲基纤维素酶和乙醇。羧甲基纤维素酶活性高和乙醇产量高的融合子不稳定。这些融合子的产酶能力很容易大部分丧失，而产乙醇的能力亦很低。而酶活及乙醇产量较低的融合子，可能才是真正的基因重组子。     

应用里氏木霉发酵制备纤维素酶固体曲的研究

应用本实验室筛选得到的纤维素酶高产菌株里氏木霉（Trichoderma reesei）150-1-1发酵制备纤维素酶固体曲,通过优化固态发酵培养基组成及发酵条件,制备得到纤维素酶活力较高的固体曲及粗酶液。实验结果表明,在原料量为10 g,麸皮与秸杆粉质量比为4：1,料液比为1：2.5,发酵时间为120 h,发酵温度为31℃,发酵起始pH值为5.5的条件下,应用里氏木霉150-1-1发酵得到的纤维素酶固体曲酶活力达到423.6 U/g。     

基于基因组重排技术的多杀菌素高产菌株选育

利用课题组前期通过不同物理化学诱变和分子生物学方法获得的8株多杀菌素产生菌为出发菌株,采用96孔板发酵培养结合生物检测的高通量筛选方法,探索了原生质体制备、再生、双亲灭活和原生质体融合等条件,并通过多轮基因组重排获得了多杀菌素高产菌株。结果表明：当菌龄为65 h、溶菌酶浓度为4 mg·ml^-1,39℃处理时间20 min时,原生质体的制备率及再生率分别为92.30%和7.66%;60℃恒温水浴90 min以上和紫外照射200 s以上为双亲灭活条件;PEG浓度为50%,在32℃下处理15 min时,原生质体融合率约为1.18%。最终获得1株产量较出发菌株提高了36.07%且遗传稳定的融合株。     

基于基因组重排技术的多杀菌素高产菌株选育

利用课题组前期通过不同物理化学诱变和分子生物学方法获得的8株多杀菌素产生菌为出发菌株,采用96孔板发酵培养结合生物检测的高通量筛选方法,探索了原生质体制备、再生、双亲灭活和原生质体融合等条件,并通过多轮基因组重排获得了多杀菌素高产菌株。结果表明:当菌龄为65 h、溶菌酶浓度为4 mg·ml-1,39℃处理时间20 min时,原生质体的制备率及再生率分别为92.30%和7.66%;60℃恒温水浴90 min以上和紫外照射200s以上为双亲灭活条件;PEG浓度为50%,在32℃下处理15 min时,原生质体融合率约为1.18%。最终获得1株产量较出发菌株提高了36.07%且遗传稳定的融合株。     

木糖渣的有机溶剂预处理及酶解性能

木糖渣是玉米芯经稀酸处理提取木糖后的残余物,一般作为燃料焚烧以提供部分热能。由于其含有丰富的纤维素组分,故可通过生物转化来生产多种化工产品,但残渣中大量木素的存在严重抑制了纤维素酶的水解效率。采用一些有机溶剂预处理可将部分木素溶出,因而可改善物料的酶解性能。采用乙醇对木糖渣进行预处理,研究了预处理条件（如温度、时间、固液比等）对木糖渣化学组分和纤维素酶解转化率的影响,并与玉米秸秆和玉米芯等进行了对比。结果表明预处理降低了木糖渣的木素含量,在固液（质量/体积）比1︰8、处理液中乙醇浓度50%（体积）、预处理温度210℃、预处理时间60 min时,木素脱除率为53.26%,预处理后木糖渣在酶解72 h时的纤维素转化率达到84.42%,比预处理前提高 14.58%。研究还发现,与木糖渣相比,有机溶剂乙醇更适合用于玉米芯和玉米秸秆酶解前的预处理。     

酶-微波辅助提取紫薯花青素的工艺研究

以紫薯为原料,0.3%盐酸-90%乙醇为溶剂（酸醇比为50∶50）,在料液比为1∶10 g/mL时,采用单因素实验法对提取工艺条件进行优化,确定了纤维素酶-微波辅助提取紫薯中花青素的最佳工艺条件为：纤维素酶用量3 mg/g,纤维素酶提取温度40℃,酶提取时间15 min,微波平均辐射功率600 W（温度70℃）,微波辐射时间7 min。对比实验结果表明,酶-微波辅助提取法较单纯盐酸乙醇浸提法,花青素的产率提高了1.86倍,而提取时间缩短了82%。     

多菌混合固态发酵产纤维素酶研究

采用多菌混合发酵可以提高纤维素酶的活力,为获得高活力的纤维素酶制剂,文中以碱处理后的甘蔗渣和麸皮作为发酵产酶培养基,采用响应面法对2株纤维素酶生产菌里氏木霉CICC40359和斜卧青霉SMX固态混合发酵条件进行了优化。结果发现在发酵温度为28℃,料水比(质量体积比)1∶2.5(g/mL)的条件下,当V(青霉)∶V(木霉)为3∶1,总接种量8%(mL/g),培养基中m(蔗渣)∶m(麸皮)为2∶1,发酵3 d时,滤纸酶活有最大值达到101.825 FPU/g,这为后续优化工作的开展提供了依据,同时高酶活下发酵液中呈现高的糖质量分数为同步产酶发酵产乙醇提供了新思路。     

褐黄孢链霉菌双亲灭活原生质体融合的研究

考察了双亲灭活条件、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、PEG浓度、融合时间、融合温度及无机离子浓度对褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)SG-2002-1和SG-2002-2原生质体融合率的影响.分别采用紫外灭活和热灭活法,灭活条件为紫外灭活2 min,热灭活为60℃水浴1 h.原生质体融合最佳条件为:50%的PEG6000,融合温度25℃,融合时间为8 min,CaCl2浓度为0.05 mol/L,MgCl2浓度为0.02 mol/L,在此条件下融合率可达5.0%.     

响应面优化木糖母液发酵产丁二酸

对产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS137发酵木糖母液产丁二酸的条件进行优化,探索利用废弃木糖母液合成高附加值丁二酸的可行性。首先通过Plackett-Burman实验设计确定影响丁二酸发酵的显著因子,然后采用最陡爬坡实验逼近各显著因子的最优区域,最后通过Box-Behnken实验设计确定各因子的最优水平。影响木糖母液发酵产丁二酸的显著因子及最优浓度分别为：木糖母液64.75g/L,玉米浆15.71g/L,碱式碳酸镁46.39g/L。在最优发酵培养条件下,丁二酸产量达到38.01g/L,比优化前提高了20.7%,与模型预测值（38.41g/L）基本一致。进一步利用2L发酵罐进行了放大试验,发酵72h丁二酸产量最高可达48.99g/L,较厌氧瓶发酵提高了28.9%,丁二酸得率为0.80g/g总糖。结果表明,采用低价的木糖母液作为底物,可为未来低成本、高效产业化生产丁二酸奠定坚实的基础。     

β-葡萄糖苷酶高温同步糖化发酵产乙醇应用研究

利用Trichoderma sp.W2所产的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及耐高温酵母Kluyveromyces marxianus NCYC 587,以气爆秸秆为原料进行高温同步糖化发酵。研究结果表明:在42℃条件下,接种体积分数10%,底物质量分数15%,发酵pH值为4.8,β-葡萄糖苷酶添加量为30 U/g底物条件下发酵效果最好。NCYC 587能迅速利用预水解产生的葡萄糖发酵并积累乙醇,同时能利用部分木糖,但在发酵后期,葡萄糖利用完全后会代谢利用一定量的乙醇,致使发酵过程中乙醇质量浓度始终维持在一个相对较低的水平。乙醇最高质量浓度达到20.56 g/L,乙醇产率达80.64%。添加嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶于高温同步糖化发酵能有效解决纤维素酶解发酵过程终端产物抑制的难题。     

糠醛渣直接同步糖化发酵生产乙醇过程比较研究

以糠醛渣为原料,直接同步糖化发酵(SSF)生产乙醇,并与水洗糠醛渣生产乙醇进行对比。通过考察不同条件来优化同步糖化发酵生产工艺条件,并分析表征了SSF过程中乙醇浓度和副产物浓度变化。优化条件为:糠醛渣底物质量分数10%,纤维素酶用量12%,无患子皂素质量浓度0.5g/L,酵母接种量7g/L,同步糖化发酵乙醇得率达到其理论得率的93.1%。与水洗糠醛渣相比,糠醛渣直接SSF过程可将原料吸附的5.50%葡萄糖部分转化为乙醇。水洗糠醛渣SSF生产乙醇所产生的副产物要远低于糠醛渣直接生产所产生的副产物,添加无患子皂素可有效抑制糠醛渣同步糖化发酵过程中副产物的产生。     

纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展

寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容,但是,重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响,分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状,并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母,但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入,限制了重组菌株的定向改造。此外,目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。因此,加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析,注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响,结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化,从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性,是未来菌株构建的重要研究方向。     

Optimization of hydrothermal pretreatment for co-utilization of xylose and glucose of cassava anaerobic residue for producing ethanol

The development of a process that could recover biofuel from industrial cellulose waste can not only reduce the negative environmental impacts by using fossil fuels, but also bring a green idea for the waste's disposing. In this study, hydrothermal pretreatment was optimized for cassava anaerobic residue, a cellulosic waste from cassava ethanol industry, to co-utilize xylose and glucose for producing bioethanol. The effect of the main pretreatment conditions, namely, temperature, solid content and time, was explored for the highest recovery of xylose in prehydrolysate and glucose in enzymatic hydrolysate. The single factor experiment results showed that the conditions for maximum xylose recovery in prehydrolysate and glucose recovery in enzymatic hydrolysate were 60 °C, 75 min, 10% solids and 160 °C, 75 min, 10% solids, respectively. Whereafter, response surface methodology(RSM) was applied to further optimize the pretreatment conditions for the maximum theoretical ethanol production through utilizing both xylose and glucose. A treatment at 163 °C, for 59 min and with 9.5%solids was found optimal, with the highest ethanol production of 20.2 mg·g~(-1) raw material. Furthermore, in order to assess the impacts of the pretreatment on cassava anaerobic residue, the changes in crystallinity and morphology for untreated and pretreated solids were investigated.     

Protoplast from <Emphasis Type="Italic">β</Emphasis>-carotene-producing fungus <Emphasis Type="Italic">Blakeslea trispora</Emphasis>: Preparation,regeneration and validation

The effects of key parameters on the preparation and regeneration of protoplast from the β-carotene-producing fungus Blakeslea trispora were discussed in this paper, including the combination of various enzymes, mycelial age, digesting time and temperature, pH value, osmotic stabilizers, pretreatment, culture medium and culture method. Under the condition of mixed enzymes in osmotic stabilizer (0.6 M NaCl) combined with 2% lysozyme, 3% cellulase and 3% snailase, the highest protoplast yield, as high as 7.48×106 protoplasts/mL, was obtained when mycelial age was 60 h at pH 5.0–6.0 with digesting for 14–16 h at 28 °C. After purification of the obtained protoplasts, they were regenerated in PDA regenerative medium using bilayer plate culture method. To validate the usability of the protoplasts, a novel plasmid with green fluorescent protein (GFP) was used in transformation for easy visual observation. The results showed that the protoplasts prepared by the optimized method were active and applicable in further gene manipulation experiments. This work was presented at 13 ^th YABEC symposium held at Seoul, Korea, October 20–22, 2007.     

栾树叶总多酚的超声波辅助提取工艺及其抗氧化活性

以10g栾树叶粉末为原料,在单因素试验基础上,采用响应面法优化栾树叶总多酚超声波辅助提取工艺,以乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度、超声波功率为因子,总多酚质量分数、总多酚得率为响应值,得到优化提取条件为乙醇体积分数72%、液料比25:1(mL:g)、提取时间15 min、提取温度60℃、超声波功率200 W以及提取3次。在此条件下,栾树叶粗提物总多酚质量分数为61.26%、总多酚得率为3.41%。抗氧化实验结果表明:栾树叶粗提物清除1,1-二苯代苦味酰基(DPPH)自由基能力显著高于BHT和Vc,IC₅₀值为103.78 mg/L;栾树叶粗提物的铁离子还原能力与BHT相当,明显高于Vc。     

马占相思树皮中原花色素提取工艺及其生物活性的研究

通过正交试验优化了马占相思树皮中原花色素的3种提取方法的最佳提取工艺条件。结果显示,传统溶剂提取法的最佳工艺为：60%乙醇、70℃、70 min、料液比1∶18（g∶mL,下同）,原花色素得率为7.42%;微波辅助提取法的最佳工艺条件为：60%乙醇、微波功率200 W、微波时间8 min、料液比1∶18,得率为7.05%;超声波辅助提取法的最佳工艺为：70%乙醇、超声波温度50℃、超声波时间50 min、料液比为1∶16,得率为8.57%。超声波辅助提取法效果最好,浸提温度低,得率高。进一步对超声波提取物不同溶剂萃取物的体外抗氧化活性和抗肿瘤活性进行了研究。结果表明,乙酸乙酯萃取物对DPPH·清除效果最好,其半数抑制浓度（IC₅₀）为17.94 mg/L,低于对照样维生素C（Vc）的IC₅₀值;乙酸乙酯萃取物对人肝癌细胞Bel-7404具有明显的抑制效果,IC₅₀值为4.86 mg/L,与抗肿瘤药依托泊苷效果相当。     

水热预水解分离相思木半纤维素及其组分与结构分析

通过水热预水解法处理相思木制得预水解液,采用乙醇沉淀回收预水解液中的半纤维素,通过条件实验优化了最佳回收半纤维素的预水解条件,然后对回收的半纤维素进行热稳定性、成分和结构分析。结果发现,获得最大半纤维素回收率的预水解条件为170℃/20min,原料中碳水化合物回收率为3.93%,回收的半纤维素中木糖为主要成分占75.56%,葡萄糖占10.71%,半乳糖占7.80%。离子色谱分析表明160℃/40min,170℃/15min、170℃/25min和180℃/15min水解条件下的回收半纤维素组分与170℃/20min时的回收半纤维素化学组分相同,但含量上略有差别;热重分析表明水解温度提高和时间延长使回收半纤维素热稳定性降低;核磁共振和红外光谱分析结果表明回收半纤维素的聚木糖主链上残留有乙酰基、阿拉伯糖和半乳糖连接。     

青霉纤维素酶酶解芦竹的研究

以青霉纤维素酶酶解芦竹,探讨了酶解温度、酶解时间、pH值和酶载量对芦竹酶解效果的影响。结果表明,青霉纤维素酶酶解芦竹的最适条件为:酶解时间72h、酶解温度45℃、pH值4.8、酶载量30FPU.g-1 DM,在此条件下,葡萄糖产率为(61.75±1.22)%、木糖产率为(40.07±6.88)%;通过添加商业酶调配酶系中不同酶活比例,可进一步提高还原糖产率,当增加β-葡萄糖苷酶至40CBU.g-1 DM时,葡萄糖产率达68.96%、木糖产率达98.16%。     

Enhanced ethanol production from enzymatically treated steam‐exploded rice straw using extractive fermentation

Alcohol fermentation of an enzymatic hydrolyzate of exploded rice straw was studied experimentally. Rice straw was treated under variable conditions, such as steam pressure and steaming time. The exploded rice straw was separated into water‐soluble material, methanol‐soluble lignin, Klason lignin, and a mixture of cellulose and a low molecular weight substance. The effects of steam explosion on the characteristics of the exploded rice straw were clarified from the point of view of the amounts of extractive components. Steam explosion was found to be effective for the delignification of rice straw and for increasing its susceptibility to enzyme hydrolysis and alcohol fermentation. The polysaccharides (cellulose and hemicellulose) in the rice straw treated at a steam pressure of 3.5 MPa with a steaming time of 2 min were hydrolyzed almost completely into monosaccharides, (ie glucose and xylose) by a mixture of Trichoderma viride cellulase (Meicelase) and Aspergillus aculeatus cellulase (Acucelase). The enzymatic hydrolyzate of exploded rice straw was converted into ethanol efficiently by Pichia stipitis and the ethanol yield from sugar was about 86%(w/w) of the theoretical value. The ethanol concentration in a membrane bioreactor coupled with a pervaporation system reached 50 gdm^?3 and was about five times higher than that in the culture broth. The energy efficiency (ratio of combustion energy of ethanol produced to energy for steam explosion) reached a maximum value at a pressure of 3.5 MPa for 2 min. © 2001 Society of Chemical Industry     

酶解-溶剂提取银杏叶活性成分工艺条件

研究了酶法与溶剂提取相结合提取银杏叶中活性成分银杏黄酮的工艺条件。通过正交试验找出纤维素酶法及溶剂提取的最佳工艺条件,通过紫外分光光度检测及紫外扫描进行产物分析。纤维素酶的最佳提取工艺条件为纤维素酶浓度40 U/mL,酶解pH值4.8,酶解温度55℃,酶解时间90 m in。溶剂提取的最优工艺条件为无水乙醇∶粗提液(体积比)=1∶10,石油醚∶粗提液(体积比)=3∶1,乙酸乙酯∶粗提液(体积比)=2∶1。酶解-溶剂提取是一种安全高效的提取方法。