重组腺相关病毒载体在基因治疗中的应用

重组腺相关病毒(rAAV)载体具有安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、能介导基因长期稳定表达等优点。因此,作为一种基因导入系统,rAAV载体在基因治疗的研究和开发中越来越受到关注。本文就rAAV载体在基因治疗中的应用作一综述。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测

目的 构建细丝蛋白A(filamin A,FLNa)shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞Hep G2和Huh7中的干扰效率。方法 通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNAFilamin1和shRNA-Filamin2,转染Hep G2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率。结果 构建的FLNa shRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,Hep G2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在Hep G2细胞中分别约为45.4%和63.7%,在Huh7细胞中分别约为76.5%和78.3%。结论 成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在Hep G2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路。     

PRELPshRNA稳定转染Saos-2细胞系的构建及鉴定

目的构建PRELP(proline/arginine-rich end leucine-rich repeat protein)基因sh RNA慢病毒表达载体,并对其在Saos-2细胞中沉默效果进行鉴定。方法针对PRELP m RNA设计2对干扰序列,化学合成后插入至慢病毒载体,将慢病毒载体以不同MOI值分别转染Saos-2细胞,筛选细胞内GFP阳性率最高MOI值。将合成的慢病毒载体以筛选出的MOI值分别转染细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,Western blot法验证两株稳定转染细胞株PRELP下调效率。结果成功构建PRELP sh RNA慢病毒载体,当MOI为50~70时,细胞内荧光蛋白表达阳性率最高;嘌呤霉素筛选到稳定转染的细胞株;构建的稳转细胞系均特异性抑制PRELP蛋白的表达。结论成功构建了PRELP sh RNA慢病毒载体,并建立稳定的Saos-2细胞PRELP下调表达细胞模型,为研究PRELP在骨关节炎中的作用奠定了基础。     

白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达

目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。     

人TPX2基因过表达慢病毒质粒的构建及其人宫颈癌细胞稳定表达株的筛选

目的构建人TPX2基因过表达慢病毒质粒,并筛选该基因的人宫颈癌HeLa细胞稳定表达株。方法经PCR法扩增人TPX2基因序列,克隆至线性化的慢病毒载体LV11中,构建重组慢病毒质粒,进行酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒及空载体LV11(LV11-NC)分别与辅助质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并检测病毒滴度。用重组慢病毒感染HeLa细胞,经不同浓度G418(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/ml)筛选TPX2基因过表达稳转细胞株,同时设阴性对照(感染LV11-NC慢病毒)及空白对照(未感染病毒)。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测各组HeLa细胞中TPX2基因m RNA转录及蛋白的表达水平。结果经酶切及测序鉴定证明重组慢病毒质粒构建成功。经293T细胞包装后,获得重组慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。采用0.6 mg/ml G418成功筛选出TPX2过表达细胞株。与阴性对照及空白对照比较,感染重组慢病毒的HeLa细胞中,TPX2基因m RNA转录及蛋白表达水平均明显升高(P0.05)。结论成功构建了人TPX2过表达慢病毒质粒,并筛选出TPX2稳定表达的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

靶向人Gadd45α基因的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞生物学功能损伤的影响

目的研究靶向人生长阻滞和DNA损伤45α(Growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α)基因和表达绿色荧光蛋白(Green fluorescert protein,GFP)的shRNA慢病毒载体对缺氧致人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells,HUVECs)表达上调的Gadd45α的沉默作用,初步阐明Gadd45α在缺氧应激致HUVECs生物学功能损伤过程中的作用。方法慢病毒包装后感染HUVECs,筛选最适MOI及感染时间。感染72h后,采用Real-time PCR和Western blot检测细胞中Gadd45αmRNA和蛋白的表达;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Transwell小室实验检测细胞的迁移率;ELISA检测细胞sFlt-1和sEng的分泌水平。结果包装后慢病毒载体的滴度为1×108TU/ml,最适MOI为20,最适感染时间为72h,对HUVECs的感染效率约为80%。Gadd45α shRNA慢病毒载体对Gadd45α基因的沉默效率可达80%,阴性对照慢病毒载体对Gadd45α的表达无抑制作用。缺氧可致HUVECs中Gadd45α的表达上调,靶向Gadd45α基因的shRNA慢病毒颗粒可有效抑制缺氧致HUVECs的凋亡,减少sFlt-1及sEng的释放,同时增强其体外迁移能力,与缺氧组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。Gadd45α蛋白的表达水平与sFlt-1及sEng的分泌水平呈正相关(r1=0.89,r2=0.77,P均<0.05)。结论沉默Gadd45α基因对缺氧应激条件下的HUVECs生物学功能具有保护作用;Gadd45α可能是一个关键上游位点,参与子痫前期时sFlt-1及sEng的释放。     

内皮抑素过表达慢病毒载体的构建及其鉴定

目的构建内皮抑素(endostatin,ES)过表达慢病毒载体,并进行鉴定。方法利用载体PUC57-ES构建GV365-ES慢病毒载体,转染293T细胞包装慢病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光;Western blot法鉴定表达的目的蛋白;HIV-1 ELISA法检测病毒滴度。结果经PCR及测序鉴定证明慢病毒载体GV365-ES构建正确;转染细胞中荧光显微镜下可见绿色荧光,表达的目的蛋白相对分子质量约23 000;病毒滴度为2.1×10~8 TU/ml。结论已成功构建ES过表达慢病毒载体,为后期该病毒载体治疗实体瘤的观察及其作用机理的研究奠定了基础。     

人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1基因siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1(Breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)基因siRNA慢病毒载体,并进行鉴定。方法针对人BCAR1基因靶序列设计并合成4条siRNA序列(PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353)及1条阴性对照序列(PLVT4),分别退火后,插入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的慢病毒载体pMagic 4.1中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,经PCR和DNA测序筛选阳性克隆,提取重组干扰质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞,进行慢病毒包装,浓缩后,采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,筛选干扰效果最好的重组慢病毒感染肺癌A549细胞,Western blot检测BCAR1蛋白的表达水平。结果成功构建了4种人BCAR1基因慢病毒干扰质粒,PLVT350、PLVT351、PLVT352和PLVT353的病毒滴度分别为3.45×108、2.13×108、3.01×108和2.47×108TU/ml;慢病毒感染3 d后,A549细胞的感染效率均达90%以上;除PLVT350外,其他3个均为有效靶点,PLVT351、PLVT352和PLVT353的沉默率分别为82%、73%和82%,BCAR1基因的表达量显著低于未转染和PLVT4组A549细胞(P<0.001);PLVT351感染的A549细胞中BCAR1蛋白的表达水平明显低于未感染和PLVT4组A549细胞(P<0.01)。结论成功构建了人BCAR1基因siRNA慢病毒载体,并建立了稳定表达的A549细胞株,为进一步探索BCAR1基因在肺癌中的相关功能及其分子机制奠定了基础。     

小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒的构建及鉴定

目的构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒,并对其进行鉴定。方法根据GenBank登录的小鼠CX3CR1基因序列设计引物,PCR扩增CX3CR1基因,将其定向克隆至载体pUbi-MCS-EGFP,经菌落PCR和序列测定,将鉴定正确的重组慢病毒质粒转染293T细胞,显微镜下观察病毒的绿色荧光,并根据荧光表达情况计算转染病毒滴度。结果 CX3CR1基因PCR产物经琼脂凝胶电泳鉴定,可见约1 000 bp的目的条带;经菌落PCR鉴定及序列测定,重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP构建正确,转染293T细胞48 h后,可见绿色荧光表达,经计算,病毒滴度为2×108TU/ml。结论成功构建小鼠CX3CR1基因重组慢病毒过表达质粒pUbi-MCS-CX3CR1-EGFP,为研究慢病毒介导的CX3CR1基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)及其归巢能力奠定了基础。     

Concurrent monitoring of operating condition deviations and process dynamics anomalies with slow feature analysis

Latent variable (LV) models have been widely used in multivariate statistical process monitoring. However, whatever deviation from nominal operating condition is detected, an alarm is triggered based on classical monitoring methods. Therefore, they fail to distinguish real faults incurring dynamics anomalies from normal deviations in operating conditions. A new process monitoring strategy based on slow feature analysis (SFA) is proposed for the concurrent monitoring of operating point deviations and process dynamics anomalies. Slow features as LVs are developed to describe slowly varying dynamics, yielding improved physical interpretation. In addition to classical statistics for monitoring deviation from design conditions, two novel indices are proposed to detect anomalies in process dynamics through the slowness of LVs. The proposed approach can distinguish whether the changes in operating conditions are normal or real faults occur. Two case studies show the validity of the SFA‐based process monitoring approach. © 2015 American Institute of Chemical Engineers AIChE J, 61: 3666–3682, 2015     

Polymer vectors via controlled/living radical polymerization for gene delivery

The design of efficient gene delivery vectors is a challenging task in gene therapy. Recent progress in living/controlled radical polymerizations (LRPs), in particular atom transfer radical polymerization (ATRP) and reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization providing a means for the design and synthesis of new polymeric gene vectors with well-defined compositions, architectures and functionalities is reviewed here. Polymeric gene vectors with different architectures, including homopolymers, block copolymers, graft copolymers, and star-shaped polymers, are conveniently prepared via ATRP and RAFT polymerization. The corresponding synthesis strategies are described in detail. The recent research activities indicate that ATRP and RAFT polymerization have become essential tools for the design and synthesis of advanced, noble and novel gene carriers.     

A sight on the current nanoparticle-based gene delivery vectors

Nowadays, gene delivery for therapeutic objects is considered one of the most promising strategies to cure both the genetic and acquired diseases of human. The design of efficient gene delivery vectors possessing the high transfection efficiencies and low cytotoxicity is considered the major challenge for delivering a target gene to specific tissues or cells. On this base, the investigations on non-viral gene vectors with the ability to overcome physiological barriers are increasing. Among the non-viral vectors, nanoparticles showed remarkable properties regarding gene delivery such as the ability to target the specific tissue or cells, protect target gene against nuclease degradation, improve DNA stability, and increase the transformation efficiency or safety. This review attempts to represent a current nanoparticle based on its lipid, polymer, hybrid, and inorganic properties. Among them, hybrids, as efficient vectors, are utilized in gene delivery in terms of materials (synthetic or natural), design, and in vitro/in vivo transformation efficiency.     

小鼠PARP-1基因RNAi表达质粒的构建与筛选

目的构建并筛选小鼠聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)基因的RNAi表达质粒,为肿瘤基因治疗探索新途径。方法根据GenBank中报道的PARP-1基因序列及shRNA设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体LipofectamineTM2000介导转染小鼠Lewis肺癌细胞株。48h后,采用RT-PCR技术检测转染细胞中PARP-1基因mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1RNAi质粒。结果4种重组PARP-1RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确。转染后48h,转染质粒pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1837的Lewis细胞PARP-1基因mRNA的转录水平降低,转染pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308组下降更明显,以其作为后续实验的有效质粒。结论已成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为PARP-1基因RNAi治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

用于基因转移的病毒小体构建策略的研究进展

病毒小体(Virosome)是含有病毒包膜蛋白的单层脂质囊泡,可作为基因转运、抗原呈递的载体.由于不含病毒基因组及膜蛋白组分可变,病毒小体作为基因载体无潜在致病性,并可人工改变靶向性.目前研究最多的病毒小体为流感病毒小体和仙台病毒小体.本文就国内外可用于基因转移的病毒小体构建策略的研究进展作一综述,为进一步开发和完善用...     

基于糖原的可成像基因载体

现有的基因载体由于较高的细胞毒性和单一的功能性在生物医药领域的应用受到限制,糖原是一种动物淀粉,是由葡萄糖结合而成的支链多糖,具有良好的生物相容性和生物可降解性,以糖原为骨架,利用糖原上的羟基引入原子转移自由基聚会（ATRP）引发点,制备得到以聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯为侧链的阳离子基因载体Gly-co-PDs,该载体侧链上的氨基可进行后续修饰,进一步被金粒子功能化后得到Gly-co-PD-Au载体,并对该载体的基因络合能力、基因释放能力、细胞毒性和CT成像能力进行研究,研究表明：该载体与目前商业化的基因载体聚乙烯亚胺和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯相比,具有更优异的基因运载能力,更低的细胞毒性和独特的CT成像功能,因此该载体可用于癌细胞基因治疗的实时可成像CT造影,在实现实时成像的基因治疗方面有潜在应用价值。     

聚酰胺-胺型多聚物作为基因载体的研究现状

近年来,新型非病毒载体在基因治疗中应用广泛,特别是树枝状阳离子多聚物,以其低毒性和特殊的结构特性,成为人们研究的重点。其文对聚酰胺。胺树枝状阳离子多聚物（PAMAM dendrimers）的结构特点、性能、基因转移机制以及近年来在基因治疗中的应用进行论述,并对它作为基因治疗载体的应用前景进行了预测。     

A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells

Nonviral gene vectors from synthetic catiomers (polyplexes) are a promising alternative to viral vectors. In particular, many recent efforts have been devoted to the construction of biocompatible polyplexes for in vivo nonviral gene therapy. A promising approach in this regard is the use of poly(ethylene glycol) (PEG)-based block catiomers, which form a nanoscaled core-shell polyplex with biocompatible PEG palisades. In this study, a series of PEG-based block catiomers with different amine functionalities were newly prepared by a simple and affordable synthetic procedure based on an aminolysis reaction, and their utility as gene carriers was investigated. This study revealed that the block catiomers carrying the ethylenediamine unit at the side chain are capable of efficient and less toxic transfection even toward primary cells, highlighting critical structural factors of the cationic units in the construction of polyplex-type gene vectors. Moreover, the availability of the polyplex micelle for transfection with primary osteoblasts will facilitate its use for bone regeneration in vivo mediated by nonviral gene transfection.     

重组腺病毒生产技术研究进展

目前基因治疗,尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术的发展,对癌症在基因水平上的认识不断深化,发现了很多对治疗癌症有帮助的基因,但临床面临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统,将这些治疗基因有效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体,重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展.