玉米赤霉烯酮生物降解研究进展

玉米赤霉烯酮是一种由镰刀菌产生的具有雌激素作用的真菌毒素,是世界上污染范围最广的一种镰刀菌素.由于物理、化学脱毒法存在较大弊端,生物去毒方法因其特异性、高效性及环境友好而日益被科学界所关注.目前玉米赤霉烯酮生物降解主要是微生物降解作用,本文紧跟国内外玉米赤霉烯酮的生物降解情况,文章介绍了降解菌株的种类,降解能力和最佳降解条件,包括降解产物毒性,降解酶基因的发掘,以及降解菌株和酶的应用方向及前景.     

玉米赤霉烯酮降解微生物的筛选与鉴定

从全国各地的土壤、污水、受污染的玉米、家畜肠道粪便等134份样品中分离得到1 628株菌落形态各异的微生物.通过以玉米赤霉烯酮为唯一碳源的无机盐培养基高通量筛选,获得8株降解玉米赤霉烯酮效果良好的菌株,其中2株降解效果较高,分别命名为Y64-3和Y84-7,降解率分别为60.08％和54.90％.经初步鉴定两株菌株均为芽孢菌.     

玉米赤霉烯酮胶体金试纸条质量验证试验

目的验证玉米赤霉烯酮胶体金试纸条对玉米基质、小麦基质样品中玉米赤霉烯酮检测的准确性。方法根据试纸条说明书方法,将不同浓度系列的玉米基体和小麦基体质控样品进行前处理后,用试纸条测定其浓度。结果检测样品为玉米基体时试纸条间无显著性差异,相对准确率为99.5%,检测结果准确;小麦基体时,试纸条显著性差异为39.03(自由度df=1),相对准确率为80.5%,检测结果差异较大。结论该方法基本可行,适合对玉米中玉米赤霉烯酮的含量进行定性检测,不适合对小麦中玉米赤霉烯酮含量进行定性检测。     

玉米赤霉烯酮降解菌的筛选与鉴定

采用富集驯化的方法从猪粪便中分离出一株能够高效降解玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)的菌株,命名为ZJ-2019-1。通过16S rDNA序列分析方法对其进行了鉴定,研究了反应时间、培养基初始pH、温度、毒素浓度等因素对ZJ-2019-1降解ZEN的影响,同时对该菌株清除ZEN的机理进行了初步探索。结果表明:ZJ-2019-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);该菌株在48 h内能将LB培养基中初始浓度为10 mg/L的ZEN去除99.7%;该菌株降解ZEN的最适温度为37℃,当反应温度低于27℃时,该菌株对ZEN的清除率明显降低;当培养基初始pH 5.0～9.0时,ZJ-2019-1对ZEN的清除率能达到88%以上,其中初始pH 7.0为降解反应的最适pH;当初始ZEN浓度在20 mg/L以内时,ZJ-2019-1对ZEN的清除率都在95%以上;ZJ-2019-1对ZEN的清除作用主要源于胞外酶的活性。     

玉米赤霉烯酮检测方法研究进展

玉米赤霉烯酮是一种具有雌激素作用真菌毒素,主要污染玉米、麦类、谷物等,严重影响农业经济及人类健康,因此有必要研究能准确、灵敏检测玉米赤霉烯酮方法。该文对玉米赤霉烯酮检测方法进行综述。     

玉米赤霉烯酮降解的研究进展

真菌毒素广泛存在于世界各地的谷物及其副产物当中.玉米赤霉烯酮(Zearalenone)作为镰刀霉毒素的代表,是影响食物安全的重要因素之一.传统的毒素清除方法包物理和化学方法.物理方法能部分清除毒素,但易破坏食物的营养物质,化学方法随着化学试剂的添加会引入不确定的危害因素.生物降解作为目前的研究热点,可在温和条件下微生物将毒素转化为无毒产物.报道了物理、化学和生物方法清除玉米赤霉烯酮的研究进展,重点对生物降解进行了综述.     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体制备及免疫分析

采用活泼酯法将玉米赤霉烯酮(Zaralenone,ZEN)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成免疫原ZEN-BSA和包被原ZEN-OVA,经紫外扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定后免疫BALB/c小鼠;挑选产生高效价和高敏感性抗体的小鼠进行抗原超强免疫,取脾细胞与SP2/0细胞融合获得1株稳定分泌抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的杂交瘤细胞(3D8),经鉴定,该抗体亚类为IgG1,轻链为k型。经体内诱生腹水并纯化获得效价为1∶2.048×106的单克隆抗体。建立了基于单克隆抗体的ZEN间接竞争ELISA法(ic-ELISA),该方法IC50和检出限分别为22.89pg/mL和10.07pg/mL。与α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应率分别为95%、8%、12%、6%和5%,而与黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素B1和赭曲霉毒素A未见有交叉反应。在玉米、大麦、小麦和燕麦中加标的回收率在86.4%~104.8%之间。该方法灵敏特异,可作为快速检测谷物中玉米赤霉烯酮的初筛方法。     

清除玉米赤霉烯酮菌株的筛选、鉴定及机理初探

通过对我国赤霉病高发区田间取样,筛选具有清除玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)活性的菌株。获得2株清除效果较好的细菌A5、D6,其中D6活性较高。通过生理特征分析、16S r DNA序列比对、GC含量及BIOLOG分析等方法,2株菌都被鉴定为红球菌,DNA-DNA同源性分析表明,这2株菌均为Rhodococcus qingshengii。灭活细胞与ZEN共培养,发现细胞无清除ZEN能力,证明A5、D6不具有吸附ZEN的活性;菌液上清液及细胞内容物与ZEN共培养,证明D6菌株中具有清除ZEN的活性成分为胞内蛋白类物质。同时,通过HPLC荧光检测,发现疑似ZEN代谢产物峰。通过筛选获得了2株可通过胞内酶活降解ZEN的红球菌,为生物法清除真菌毒素提供参考。     

洛河污泥菌群分析及去除玉米赤霉烯酮的菌种筛选鉴定

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的一种特殊的生物毒素,对粮食和饲料危害巨大。生物法去除该毒素是经济环保的做法。实验旨在分析洛河污泥中的主要微生物种群,并从中筛选能够去除ZEN的微生物菌种。实验首先采用宏基因组测序技术,对样品中的微生物种群进行分析,并在此分析结果的指导下配制添加5μg/mL ZEN的MRS、NA、LB三种改良培养基,采用好氧和厌氧方式对样品中的优势菌种进行筛选,对初筛菌株通过酶联免疫法(ELISA)测定其对改良液体培养基中ZEN的去除率,筛选出高去除率的菌株。通过宏基因组分析,洛河河道污泥中微生物种类丰富,在属的水平上,以芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)为主,在种的水平上,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus damuensis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为主要菌种。改良培养基初筛到47株去除ZEN的微生物菌种,经形态和分子鉴定所筛菌种大部分为植物乳杆菌、乳酸片球菌、粪肠球菌、海洋芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等微生物菌种。以NA、LB培养基在好氧培养方式筛选的微生物菌种对ZEN的去除能力较高,去除率可达80%。     

降解玉米赤霉烯酮芽孢杆菌的筛选和鉴定

从400株芽孢菌中筛选到对玉米赤霉烯酮(ZEN)有较好清除作用的两株芽孢杆菌373-2和411-1,分别与玉米赤霉烯酮(15μg/m L)共培养8 h和6 h后,将其完全清除。通过16S rDNA序列分析鉴定,373-2和411-1分别为一株新种芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对两株菌的玉米赤霉烯酮清除机理进行初步分析,结果表明,清除作用主要源自菌株胞外酶的降解活性。     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

醇洗法脱除玉米胚芽粕中玉米赤霉烯酮的研究

根据玉米赤霉烯酮(ZEN)易溶解于乙醇的原理,利用乙醇对玉米胚芽粕进行浸洗,脱除其中ZEN并提高蛋白质含量和改善感官品质。以玉米胚芽粕为原料,研究乙醇体积分数、醇洗温度、料液比、醇洗时间、醇洗次数对ZEN脱除效果的影响。在单因素试验的基础上,采用正交试验研究确定醇洗法脱除玉米胚芽粕中ZEN的最佳工艺条件为:乙醇体积分数80%,醇洗温度40℃,料液比1∶15,醇洗时间50 min,醇洗次数1次。在最佳工艺条件下,醇洗后玉米胚芽粕中ZEN含量从906.60μg/kg降低至179.21μg/kg,达到国标对饲料粕500μg/kg限量要求,ZEN脱除率达到80%以上,醇洗玉米胚芽粕中蛋白质含量从17.3%提高至21.8%,且色泽、风味等感官品质得到改善。     

小豆内生真菌的筛选鉴定及其产玉米赤霉烯酮的可能性探究

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是目前全球范围污染谷物最广泛的霉菌毒素之一,对人体和动物健康都会产生极大威胁,目前从市售小豆检测到ZEN。【目的】筛选暴露ZEN的小豆内生真菌,结合经典方法和分子生物学方法鉴定所筛选内生真菌,并探索菌株潜在的ZEN产生风险。【方法】以暴露ZEN的小豆为样本,将分离纯化后的内生真菌进行经典形态观察;同时扩增真菌核糖体保守序列ITS1、ITS4,镰刀菌特异基因序列FU1、FU2确定小豆中镰刀菌种属,同时通过ZEN玉米赤霉烯酮产毒控制基因pks13进行PCR扩增,分析菌株ZEN合成的潜在风险。【结果】鉴别出3株镰刀菌,其中2株初步鉴定为砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)、1株为花腐镰刀菌(Fusarium napiforme),未检测出ZEN合成关键基因;1株玛利节菱孢霉(Arthrinium marii),分子检测具有产ZEN玉米赤霉烯酮毒素的可能性。将以上4株菌分别回接至ZEN的产毒培养基,LC-MS/MS法未检测出ZEN毒素。【结论】暴露ZEN的小豆具有内生镰刀菌,存在可能产ZEN的内生节菱孢霉;回接培养基未检测到ZEN,但不排除小豆产生ZEN的风险。     

SPE-HPLC-MS/MS测定粮食中玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇

建立了以乙腈-水(84∶16,v/v)为提取溶剂、正己烷萃取和HLB固相萃取(SPE)净化、水和乙腈C18反相色谱梯度洗脱、电喷雾负离子多反应监测模式(MRM)同时测定粮食中玉米赤霉烯酮(ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)2种物质含量的HPLC-MS/MS检测方法。结果表明,ZEN和DON检出限(以信噪比S/N=3计)依次为0.1μg/kg和2μg/kg,定量限(以信噪比S/N=10计)依次为0.3μg/kg和6μg/kg;两者线性范围分别为0.20~25μg/L(相关系数r=1.000 0)和4.0~500μg/L(相关系数r=0.999 9);不同样品2种目标物3个水平的加标回收率在88.7%~102.3%之间,相对标准偏差(RSD)在2.4%~7.3%之间。应用该方法对所检小麦样品进行分析,结果均发现严重污染样品的2种目标毒素。     

Aflatoxin B1, zearalenone and deoxynivalenol in feed ingredients and complete feed from central China

Between 2012 and 2014, 2528 feed ingredient and complete feed samples were collected from central China. Numbers of 2083, 255 and 190 samples were analysed for aflatoxin B1 (AFB1), zearalenone (ZEN) and deoxynivalenol (DON), respectively, by high-performance liquid chromatography in combination with UV or fluorescence detection. The incidence rates of AFB1, ZEN and DON contamination of feed ingredients and complete feeds were 33.9%, 90.2% and 77.4%, respectively. The percentage of positive samples for AFB1 ranged from 13.1% to 97.1%. Cottonseed meal presented the most serious contamination by AFB1. ZEN and DON contamination levels of feeds ranged from 50% to 100%, indicating serious contamination over the studied 3-year period. This study demonstrates that AFB1, ZEN and DON contamination of feeds in central China is serious and differs over the years. Feeds are mostly contaminated with ZEN, followed by DON and AFB1.     

莱克多巴胺人工抗原及抗体的制备

莱克多巴胺是一种禁用β-兴奋剂,建立莱克多巴胺药残的快速检测方法是实现对其进行有力监控的有效途径,而莱克多巴胺抗体是快速免疫检测法的基本试剂。本实验用全新的方法研究了莱克多巴胺免疫原的合成,采用对氨基苯甲酸(ABA)和1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDE)将莱克多巴胺分别和cBSA、cOVA偶联,合成了莱克多巴胺的免疫原和包被抗原,并对其进行了紫外分析。用免疫原免疫新西兰大白兔,获得了高灵敏度和特异性的莱克多巴胺多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的IC50值为4.34ng/ml,所得多克隆抗体效价达到102400。     

土霉素完全抗原的制备及ELISA检测方法的建立

为制备土霉素(Oxytetracycline,OTC)完全抗原,获得免疫学特性良好的土霉素鼠源多抗血清并建立OTC免疫学检测方法,采用重氮化法在OTC分子上引入羧基,进而利用改进碳二亚胺法将其与载体蛋白偶联制备完全抗原,通过红外扫描、紫外扫描和凝胶电泳鉴定其偶联效果,然后将完全抗原免疫BLAB/c小鼠获得多抗血清(pAb)并对其免疫学特性进行鉴定,通过优化条件建立OTC间接竞争ELISA检测方法。结果表明,偶联效果良好,免疫的4只小鼠多抗血清效价均达到1∶12 800;4只小鼠多抗血清均有抑制效果,其中2号小鼠产生的多抗血清效果最佳,基于该多抗血清建立的OTC间接竞争ELISA检测方法半数抑制浓度(IC_(50))为32.92ng/mL,检测限(LOD)为1.3ng/mL,牛奶样品中添加回收率在84.70%～87.45%,与金霉素、四环素的交叉反应率分别为5.27%,4.10%,与其他竞争物交叉反应率0.4%。该试验成功合成了OTC完全抗原,获得了免疫学特性良好的OTC多抗血清,并建立了OTC免疫学检测方法。     

新型氨基甲酸乙酯人工抗原的制备与表征

目的合成新型氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate,EC)人工抗原并对其效果进行表征分析。方法用4-(二苯基羟甲基)苯甲酸对EC衍生化合成半抗原,用核磁氢谱(proton nuclear magnetic resonance, NMR)、核磁碳谱和质谱法(massspectrometry,MS)对其结构进行表征;用活化酯法将EC半抗原与牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)偶联得到EC人工抗原。用紫外光谱和荧光光谱法对人工抗原进行表征并计算偶联比,用考马斯亮蓝法测定蛋白含量,间接竞争酶联免疫法鉴定其免疫活性。结果 EC半抗原结构与理论结构一致,半抗原与BSA成功偶联,偶联比为13:1,冻干粉的蛋白含量为0.695 mg/mg,用该新型人工抗原免疫小鼠,得到的抗血清效价为1:10000,且特异性较好。结论该新型氨基甲酸乙酯半抗原具有较好的免疫活性。     

降解玉米赤霉烯酮菌株的鉴定及其发酵条件优化

从土壤样品中得到一株能降解玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)的菌株ZENL09,对该菌株的形态特征、生化理化特性和16r sRNA进行分析鉴定,并通过单因素实验得出ZENL09的较优的发酵条件。结果表明:ZENL09为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其较优的发酵条件为:发酵时间24 h,发酵温度33℃,摇床转速200 r/min,装液量25 mL/250 mL,接种量3%,在此条件下,ZENL09发酵上清液对ZEN的降解率达到了96%。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原和多克隆抗体的制备

对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的两种半抗原合成方法进行对比研究,合成半抗原,并采用活化酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联制备得到免疫原,通过特定程序免疫日本大耳白兔获得了多克隆抗体.抗血清效价为1∶32 000,proteinA-sepharose 4B 亲和层析纯化的DON抗体与DON、3-AC-DON(3-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、15-AC-DON(15-乙酰氧基脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、T-2毒素、OTA(赭曲霉A)、ZEN (玉米赤霉烯酮)的交叉反应率分别为:100%、500%、2.50%、0.10%、0.01%、0.01%,表明了所制备DON抗体的高特异性.