基于转录组测序的异常汉逊酵母菌不同发酵时期差异表达基因功能分析

异常汉逊酵母(Hansenula anomala)具有较强的发酵力和酯化力,并能积累色氨酸。为了进一步理解其发酵过程中的基因表达与代谢的关系,在转录组测序的基础上,利用生物信息学方法,分别对5个发酵时间点(0、24、48、72、96 h)的异常汉逊酵母菌的差异表达基因的功能进行了分析。结果表明,各发酵时间点与其相邻的上一个时间点相比,发酵24、48、72、96 h的上调表达的基因数量分别为585、487、154、615,下调表达的基因数量分别为1 112、725、5、245。差异表达基因功能的GO富集和KEGG通路富集结果表明,异常汉逊酵母菌的代谢强度在0～48 h下降,48～96 h上升,并且在96 h时,具有较强的代谢活动和遗传信息处理能力。产色氨酸通路的差异基因表达矩阵分析表明,异常汉逊酵母菌合成色氨酸的速率在0～24 h下降,随后上升;而色氨酸的分解速率从0～48 h上升,随后下降。这些结果可为异常汉逊酵母菌的分子育种及其代谢调控研究提供理论依据。     

重组酵母菌N6076的差异表达基因功能及甲羟戊酸代谢分析

为了解重组酵母菌N6076不同发酵时间的差异表达基因信息及甲羟戊酸(mevalonate,MVA)代谢状况,以重组酵母菌N6076及其原始菌株Kh08为研究对象,基于转录组测序和MVA测定,分析和比较了两者在3个发酵时间点(0、48和96 h)的差异表达基因的功能。GO功能分析结果表明,重组菌株N6076新增了14项生物学过程、2项细胞组分和2项分子功能,涉及1140个差异表达基因。KEGG代谢分析结果表明,重组菌株N6076新增了13条代谢通路,涉及77个差异表达基因,其中新增的萜类骨架生物合成途径涉及5个差异表达基因。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)基因表达与MVA的LC-MS/MS测定结果表明,在整个发酵过程中MVK基因表达量与MVA产量的变化趋势一致。该研究为进一步认识重组酵母菌N6076的基因表达与MVA代谢调控提供了依据。     

亚硒酸钠促进多形汉逊酵母DL-1合成谷胱甘肽的转录组学分析

为解析Na2SeO3诱导多形汉逊酵母DL-1(Hansenula polymorpha DL-1,HP-DL-1)生物合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的分子机制.通过DTNB法以及Illumina测序平台对比分析不同浓度Na2SeO3对HP-DL-1合成GSH产量的影响及Na2SeO3诱导下GSH高产菌株...     

黄皮转录组测序及抗氧化相关基因的挖掘

为从分子水平研究黄皮果实抗氧化酶抑制褐变的机理,以热激(heat treatment,HT)、程序降温(low temperature conditioning,LTC)和对照(CK)组处理后3℃贮藏的黄皮果实为材料,研究温度对黄皮果实褐变及抗氧化效果的影响,并应用转录组测序技术对黄皮果实RNA进行测序分析.结果 表明...     

新疆两种亚麻籽转录组分析及籽油香气差异基因挖掘

为丰富亚麻籽转录组数据信息,在分子水平上探究不同品种亚麻籽所得亚麻籽油的香气差异原因,本研究选择2种新疆特色亚麻籽(伊亚-3号和天亚-6号),通过Illumina高通量测序平台对其进行转录组测序,并通过多种生物信息学方法对数据进行统计分析.结果 表明:共获得61995756条高质量的clean reads,将测序数据进...     

D-果糖对鲁氏酵母菌生理特性及转录组学的影响

为揭示D-果糖调控对鲁氏酵母菌代谢的影响,研究了鲁氏酵母菌响应D-果糖的生理特性和转录组学结果变化。结果表明,D-果糖的添加显著提升了鲁氏酵母菌细胞生长,降低了发酵液pH值。转录组数据分析表明:与对照组相比较,鲁氏酵母菌经D-果糖调控后,发酵3 d时酵母菌的差异基因为7 469个,5 d时为4 611个,7 d时为8611个。GO富集分析发现:D-果糖调控下的鲁氏酵母菌发酵3d时,其分子功能差异基因比对照组显著增加;发酵5 d时,细胞组分差异基因显著增多;发酵7 d时,生物过程差异基因显著增多。KEGG pathway结果表明,D-果糖调控下,果糖代谢及其他次生代谢和氨基酸代谢等多种与鲁氏酵母菌代谢密切相关的途径差异显著。LC-MS/MS分析表明:D-果糖调控后的鲁氏酵母菌在发酵进行到3 d时产生的酸类物质增多;发酵至5 d时,其酮类和酯类等主要香气物质高于对照组,呋喃酮含量是对照组的7.5倍;发酵至7 d时,代谢物之间差距减少。本研究旨在对糖调控下鲁氏酵母菌的生理特性变化及产香的分子机制提供理论依据。     

DEHP胁迫下萝卜的亚显微结构及应答转录组分析

为探究邻苯二甲酸二辛酯(diethylhexyl phthalate,DEHP)胁迫下蔬菜差异基因的表达调控,以萝卜为试验材料,以空白处理为对照,在不同DEHP浓度(10、30、50 mg/kg)处理下,利用透射电镜观察萝卜块根亚显微结构,运用转录组高通量测序技术(RNA sequencing,RNA-Seq)技术对萝卜块根样品进行应答转录组分析。结果表明:DEHP胁迫会破坏萝卜块根细胞的结构,导致细胞壁加厚变形,部分断裂,线粒体嵴数减少,内部嵴断裂变模糊甚至解体,且污染浓度越大,破坏越严重。在应答转录组分析中,10、30和50 mg/kg 3个污染组分别获得52707 576、47 261 670和48 651 920条Clean Reads,与对照组相比,分别产生9885、9 385和11 880个差异表达基因。基因本体(Gene Ontology,GO)分析结果显示:差异表达基因主要富集在代谢过程、刺激响应和催化活性等生物学过程中。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析结果表明:差异表达基因主要参与...     

桃果实冷害形成过程关键代谢途径的转录组学研究

桃子在低温贮藏过程中易产生冷害（chilling index, CI）,严重影响其商品性。为探究桃果实冷害形成过程中各类代谢途径的变化规律,用转录组学技术分析了‘湖景蜜露’桃果实在低温和常温货架期贮藏过程中的转录水平变化。结果表明,在桃果实贮藏过程中共鉴定出125条代谢途径发生变化。通过对其中5条关键代谢途径的分析发现,在桃果实冷害形成过程中伴随着氧化/还原型谷胱甘肽转化途径、蔗糖合成分解途径、果胶降解途径的激活,以及淀粉合成途径、茉莉酸合成和信号转导途径的抑制。这些代谢途径的变化可能涉及桃果实受到低温胁迫的响应机制,该结果为进一步探究桃果实冷害的调控机理提供理论依据。     

哈密瓜低温贮藏期间激素代谢的代谢组和转录组分析

哈密瓜在采后贮藏过程中容易受到低温胁迫。植物激素在调节作物响应低温胁迫的反应中起着重要作用。为探讨低温胁迫下哈密瓜内源激素代谢的分子机制,采用靶向代谢组学和转录组学方法研究了不同贮藏温度（3 ℃和21 ℃）对哈密瓜贮藏品质、内源激素代谢和基因表达水平的影响。结果表明,低温贮藏使哈密瓜保持了较高的质量和硬度,延缓了腐烂,抑制了丙二醛和过氧化氢含量的增加,但也造成一定程度的冷害。代谢组学分析表明,低温贮藏抑制了哈密瓜果实中脱落酸的积累,但促进了吲哚乙酸和水杨酸含量的积累。转录组分析表明,低温显著影响了植物激素信号转导途径中关键基因（如PYR/PYLs、IAAs、TIRs、GH3、NPRs、TGAs等）的表达水平,其中bHLH13、IAA9-like、IAA27、MYC2-like和PYL4等关键基因的表达水平通过实时定量聚合酶链式反应实验结果得到了验证。这些发现为哈密瓜低温贮藏过程中植物激素代谢的分子机制提供了理论依据。     

培养基中添加植物生长调节剂的蛹虫草转录组学分析

为探究培养基中添加植物生长调节剂(GN-01)对蛹虫草基因表达变化的影响,采用高通量测序技术对培养基中添加GN-01栽培的蛹虫草和对照组蛹虫草鲜品进行转录组测序分析,采用生物信息学方法对差异基因进行功能注释和通路分析。结果表明:培养基中添加GN-01后,蛹虫草子实体中显著差异基因有189个,共富集到29条代谢通路;差异基因主要参与次生代谢产物的生物合成、精氨酸和脯氨酸的代谢、植物过氧化物酶体路径。试验证实GN-01能够激活与抗病能力有关代谢通路,在提高蛹虫草抗病效应中发挥重要作用。     

异常汉逊酵母发酵乙酸乙酯条件优化和代谢研究

以高粱和大曲为原料,用一株异常汉逊酵母NZ-19-1为发酵剂,通过正交试验优化了其发酵原料配比及发酵条件。结果表明,该酵母菌在葡萄糖含量27%的高粱水解液中,辅以4%的大曲,初始pH值为5.0,装料系数0.25,25℃下采用静置方法发酵13天,可获得富含乙酸乙酯含量的酒醅,初步建立了一种乙酸乙酯含量较高的勾兑用白酒的生产工艺。通过对这株高产菌特征性代谢产物和醇酰基转移酶的研究,得出该菌株合成乙酸乙酯的途径是:先利用葡萄糖生成乙酸和乙醇,乙酸在HSCoA的作用下激活为乙酰-CoA,与乙醇在醇酰基转移酶的催化作用下合成乙酸乙酯。这一结果可为今后将该菌株运用于富含乙酸乙酯的勾兑用白酒的生产提供技术参考。     

一株异常汉逊酵母的分离与鉴定

从白酒酒曲中分离得到1株酵母菌S-1,经形态学观察和生理生化特征比较,S-1被确定为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)。将S-1分别置于乙醇体积分数为0%、8%、10%、12%、14%和16%的YPD培养基上,28℃下恒温培养144h,结果表明,S-2可耐12%的乙醇。对糖度为13°Brix的500mL甘蔗糖液进行发酵,发酵产物经初馏和精馏后得到70mL馏分。GC分析结果表明,该馏分为高纯度的乙醇,乙醇得率为0.52g乙醇/g甘蔗糖液,接近理论转化率。该实验中所分离的异常汉逊酵母菌株S-1是1株可用于甘蔗产燃料乙醇的理想菌株。     

酿酒酵母和异常汉逊酵母混合发酵黄酒工艺研究

以酿酒酵母和异常汉逊酵母为黄酒发酵菌种,分别考察2种酵母对18 °Bx糖化液的发酵特性,结果表明酿酒酵母产酒精(9.9% vol)能力强于异常汉逊酵母(6.8% vol),异常汉逊酵母产挥发酯(2.41 g/L)显著高于酿酒酵母(0.53 g/L)。比较混菌发酵途径,顺序混合发酵酒精度(8.1% vol)略低于同时混合发酵酒精度(8.7% vol),挥发酯含量(1.59 g/L)显著高于同时混合发酵(0.56 g/L)(P<0.05),结合发酵过程理化指标和感官评价结果,选择顺序混合发酵途径较为合适。通过单因素和Box-Benhnken中心组合试验设计,选择主发酵温度、pH值、酵母接种量3个因素对顺序混合发酵黄酒产品的挥发酯含量进行响应面优化,结果显示:顺序混合发酵黄酒的最佳参数为:发酵温度31.5 ℃,接种量1.0×107个/mL,pH 4.2。验证试验表明,在此条件下顺序混合发酵黄酒的挥发酯含量为(1.66±0.028)g/L,与预测值1.70 g/L相差不大,比酿酒酵母单独发酵提高213%。本研究为非酿酒酵母在黄酒发酵上的应用奠定了基础。     

Genetic analysis in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha

Techniques are described for the induction, isolation, and characterization of mutants of Hansenula polymorpha. In addition, techniques for controlled passage through the life cycle and genetic analyses, including complementation, tetrad and random spore analysis, have been developed and used to assign mutants to 62 complementation groups. We report that organism conforms to the expected genetics of a homothallic yeast and displays a Mendelian segregation of genes through meiosis. Preliminary mapping data are presented indicating linkage of three genes on a single linkage fragment. Enymatic analysis of methanol-non-utilizing mutants identified one class which is totally deficient in the key assimilatroy enzyme, dihydroxyacetone synthase.     

Constitutive expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha using the PMA1 promoter

The methylotrophic yeast H. polymorpha is a popular system for the expression of recombinant proteins using the strong and regulatable methanol oxidase (MOX) promoter. Here we show that the constitutive PMA1 promoter can programme the expression of two heterologous proteins, glucose oxidase and human serum albumin. A constitutive promoter provides a useful additional facility to the H. polymorpha expression system because it allows a simplified fermentation regime, avoids the use of methanol, which is both toxic and an explosive hazard, and allows more flexibility for ectopic gene expression during the course of academic studies. A fragment previously isolated in a promoter screen, using glucose oxidase (GOD) as a reporter gene, was shown to consist of the promoter region and the first 659 bp of the H. polymorpha PMA1 gene, encoding the plasma membrane H(+)-ATPase. When the PMA1 promoter was optimally aligned with the GOD coding region, it produced 185 mg/l glucose oxidase in high cell density fed batch fermentations, whereas in previous experiments using the MOX promoter, a yield of 500 mg/l was recovered. The PMA1 promoter was also used to express recombinant human serum albumin (rHA) in H. polymorpha. In high cell density fermentations the PMA1 promoter produced 460 mg/l rHA, whereas 280 mg/l rHA was obtained using the MOX promoter. Taken together, these experiments show that the HpPMA1 programmes the constitutive expression of recombinant proteins and provides a yield comparable to that from the MOX promoter.     

酿酒酵母蔗糖关键代谢途径基因的敲除及其生长特性的变化分析

该研究以酿酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）IMX581为出发菌株,利用Crispr-Cas9基因编辑的方法敲除其蔗糖消耗途径中的蔗糖转化酶基因Suc2和麦芽糖酶基因MAL32、MAL12、MAL22,构建工程菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22,并对其生长特性及蔗糖消耗情况进行分析。结果表明,当初始OD600 nm值为0.1时,菌株IMX581△Suc2在以蔗糖为唯一碳源的培养基上仍然可以生长,但培养56 h时,生物量是出发菌株IMX581的52%,而菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22几乎不生长。当初始OD600 nm值为0.1、5.0及10.0时,菌株IMX581△Suc2和IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22培养72 h后,蔗糖的消耗率较出发菌株IMX581均显著下降,分别为28.5%、35.5%、38.5%和7.0%、18.4%、22.5%。因此,成功构建了显著降低蔗糖消耗的菌株IMX581△Suc2△MAL32△MAL12△MAL22,为研究酿酒酵母对蔗糖的利用及调控提供了参考。     

Cloning, sequencing, and expression of H.a.YNR1 and H.a.YNI1, encoding nitrate and nitrite reductases in the yeast Hansenula anomala

A single Hansenula anomala genomic DNA fragment containing the genes H.a.YNR1 (yeast nitrate reductase) and H.a.YNI1 (yeast nitrite reductase) encoding nitrate and nitrite reductase, respectively, was isolated from a lambda EMBL3 genomic DNA library. As probe, a 3.2 kb DNA fragment isolated from a lambda gt11 H. anomala genomic DNA library screened with antiserum anti-NR from H. anomala was used. H. a.YNR1 and H.a.YNI1 genes are separated by 473 bp and encode putative proteins of 870 and 1077 amino acids, respectively, with great similarity to nitrate and nitrite reductases from other organisms. Northern blot analysis revealed that both genes are highly expressed in nitrate, very low in nitrate plus ammonium, and no expression was detected in ammonium or nitrogen-free media. Levels of nitrate reductase and nitrite reductase were very low or undetectable by Western blot analysis in nitrogen-free and ammonium media, whereas both proteins were present in nitrate and ammonium plus nitrate media. The nucleotide sequence Accession No. is AF123281.