原生质体紫外诱变选育达托霉素高产菌株

研究了达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌D-30原生质体制备及再生的条件。结果显示,D-30原生质体制备及再生的最适条件为:在种子培养基中添加0.6%的甘氨酸,当种子培养30h后,用浓度为2mg·mL-1的溶菌酶破壁,酶解温度为32℃,酶解时间为75min。在最适条件下制得的原生质体经紫外诱变处理后培养,最终筛选得到高产菌株D-35,该菌株的平均发酵单位较出发菌株提高了87.9%。     

基于基因组重排技术的多杀菌素高产菌株选育

利用课题组前期通过不同物理化学诱变和分子生物学方法获得的8株多杀菌素产生菌为出发菌株,采用96孔板发酵培养结合生物检测的高通量筛选方法,探索了原生质体制备、再生、双亲灭活和原生质体融合等条件,并通过多轮基因组重排获得了多杀菌素高产菌株。结果表明:当菌龄为65 h、溶菌酶浓度为4 mg·ml-1,39℃处理时间20 min时,原生质体的制备率及再生率分别为92.30%和7.66%;60℃恒温水浴90 min以上和紫外照射200s以上为双亲灭活条件;PEG浓度为50%,在32℃下处理15 min时,原生质体融合率约为1.18%。最终获得1株产量较出发菌株提高了36.07%且遗传稳定的融合株。     

基于基因组重排技术的多杀菌素高产菌株选育

利用课题组前期通过不同物理化学诱变和分子生物学方法获得的8株多杀菌素产生菌为出发菌株,采用96孔板发酵培养结合生物检测的高通量筛选方法,探索了原生质体制备、再生、双亲灭活和原生质体融合等条件,并通过多轮基因组重排获得了多杀菌素高产菌株。结果表明：当菌龄为65 h、溶菌酶浓度为4 mg·ml^-1,39℃处理时间20 min时,原生质体的制备率及再生率分别为92.30%和7.66%;60℃恒温水浴90 min以上和紫外照射200 s以上为双亲灭活条件;PEG浓度为50%,在32℃下处理15 min时,原生质体融合率约为1.18%。最终获得1株产量较出发菌株提高了36.07%且遗传稳定的融合株。     

美伐他汀产生菌的原生质体诱变育种

以美伐他汀产生菌SIPI-8915为出发菌,研究了影响原生质体形成和再生的各种因素并选出最佳条件,其再生频率达到23.5%;并对原生质体进行紫外诱变育种,筛选到变异株.该菌株摇瓶发酵效价比对照提高30%,传代稳定好.     

原生质体紫外诱变技术选育烟酰胺高产菌株

采用紫外线和氯化锂复合诱变技术,对烟酰胺产生菌Rhodococcus.equi的原生质体进行了诱变育种。原生质体制备和再生的最佳条件为:甘氨酸浓度2.6%,菌龄36 h,酶浓度2.0 mg/mL,酶解温度32℃,酶解时间40 min,原生质体的形成率达到94.6%。复合诱变的最佳条件:紫外线照射80 s,氯化锂浓度0.6%。最终获得一稳定高产3-氰基吡啶水合酶的菌株Rhodococcus.equi LY-PM09,其产酶酶活性为1 247 U/mL,比出发菌株提高了91.3%。     

一株橘绿木霉TR673原生质体的制备、再生及融合研究

从齐齐哈尔市大豆根围土壤中分离得到1株木霉菌株TR673,经分子生物学及形态学鉴定,确定其为橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。采用崩溃酶对TR673的菌丝体进行裂解制备原生质体,分别采用50℃水浴5 min和紫外线照射(20 W、40 cm)90 s对原生质体进行灭活,再将灭活的原生质体用聚乙二醇融合法进行融合,并对TR673原生质体的制备和再生条件进行了优化。结果表明,用20 g·L^-1的崩溃酶对培养16 h的TR673菌丝体酶解(裂解)5 h时,原生质体产量最大,达到1.2×10⁶个·mL^-1。用ZS1培养基对原生质体进行再生培养,其再生率可达12.3%。融合菌株TR673-3的哌珀霉素产量达1 282.67 mg·L^-1,较原始菌株TR673的哌珀霉素产量提高了18.11%。本研究为后续的橘绿木霉基因组的编辑、转化以及其它木霉菌原生质体的制备、再生与融合等实验提供了参考依据。     

应用原生质体诱变技术筛选井冈霉素高产菌种的研究

诱变育种是抗生素菌种选育中最常规而又最有效的方法，对微生物原生质体进行诱变育种是目前人们为获取高产菌种和保持高产菌种特性的一种行之有效的方法。本文研究井冈霉素产生菌原生质体制备及再生条件，并通过对原生质体进行紫外线诱变处理，筛选得到井冈霉素高产菌种PU-922，摇瓶发酵水平可达到每毫升26 586单位（以A组份计，补足蒸发量后数据，下同），比出发菌株提高34.5%。 1 材料与方法 1.1 菌株 井冈霉素产生菌UV-199，浙江钱江生物化学股份有限公司菌种室提供。 1.2 培养基及试剂 1.2.1 斜面及培养基 葡萄糖1.0%，L-天冬…     

用原生质体法诱变选育林可霉素高产菌株

去壁后的微生物原生质体外层仅存原生质体膜,在诱变过程中,直接与诱变剂接触,诱变剂迅速内溶并与核作用.弥补了常规诱变育种表型延迟和严重的遗传分离现象的缺点,我们以林可霉素生产菌G4为出发菌株,首先制备原生质体,再通过对原生质体进行紫外诱变,经过平皿再生,再经过摇瓶初筛、复筛,得到一株生产性能比出发菌株提高3.2%的突变株Y19.     

基因组重排技术选育乳链菌肽高产菌株

目的采用基因组重排(Genome shuffling)技术选育乳链菌肽高产菌株。方法以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)G7分别经超声波、硫酸二乙酯(Diethyl suilate,DES)及超声波和DES复合诱变后获得的3株突变株S-1、D-1、F-1为出发菌株,制备原生质体,并进行再生及灭活,采用基因组重排技术选育乳链菌肽高产菌株。结果原生质体的制备率和再生率分别为98.5%±1.2%和13.6%±0.9%;原生质体的灭活条件为紫外线灭活120s及60℃热处理20min,原生质体的致死率可达100%;通过2轮基因组重排,成功选育出1株高产乳链菌肽菌株R2-6,其比原始菌株G7的乳链菌肽的产量提高了69.8%。结论已成功选育出了1株产量大幅提高、遗传稳定的乳链菌肽菌株。     

紫外诱变季也蒙毕赤酵母原生质体筛选木糖醇高产菌株

目的通过对季也蒙毕赤酵母原生质体进行紫外诱变,筛选遗传性稳定的木糖醇高产菌株。方法制备季也蒙毕赤酵母DQ11的原生质体,计算原生质体生成率及再生率,并对制备过程中的酶浓度(0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)、酶解温度(26、28、30、32和34℃)及酶解时间(1、2、3、4和5 h)进行优化。对采用最佳酶解条件制备的原生质体进行紫外诱变,分别检测诱变30、60、90、120和150 s时原生质体的致死率,经重复筛选,采用高效液相色谱法测定菌株发酵液的木糖醇含量,并检测筛选出的木糖醇高产菌株的遗传稳定性。结果最佳酶解条件为:酶浓度1.5%,酶解温度30℃,酶解时间3 h,该条件下制备的原生质体经紫外诱变90 s(最佳诱变时间)后,获得1株高产木糖醇诱变菌株YZ-57,其发酵液的木糖醇含量为9.78 g/L,比出发菌株DQ11提高了186%,且具有良好的遗传稳定性。结论季也蒙毕赤酵母原生质体经紫外诱变,成功获得一株季也蒙毕赤酵母木糖醇高产菌株YZ-57,且具有良好的遗传稳定性。     

絮凝剂产生菌KJ-10原生质体的制备及再生条件研究

从活性污泥中筛选出具备较高絮凝活性的菌株KJ-10.对菌株KJ-10原生质体的制备和再生的影响因素进行了考察.结果表明,KJ-10原生质体制备和再生的优化务件为:以1%接种量在CM液体培养基中活化12 h,酶解前加入5 mol·L<'-1>甘氨酸预处理12 h,酶浓度为0.1 mg·mL<'-1>,37℃水浴酶解120...     

原生质体诱变提高亚麻刺盘孢ST对底物DHEA的耐受性和转化率

采用原生质体诱变技术选育出一株耐高浓度底物去氢表雄酮（DHEA）的高产亚麻刺盘孢菌株（Colletotrichum lini） ST-0317,并研究了其转化特性。以C. lini ST为出发菌株,考察了其原生质体制备与再生的最适条件,随后对其原生质体进行等离子诱变,最终选育得到优势突变株ST-0317。该菌株在底物耐受性提高的同时也具有良好的遗传稳定性,在DHEA投料浓度高达10g/L的条件下,产物7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率可达36.9%,比出发菌株提高了50%。     

Mutation of Cl.beijerinckii protoplasts by 60Co-γ irradiation

以产丁醇菌Cl.beijerinckii为出发菌株,将其原生质体化后进行⁶⁰Co-γ辐照诱变,筛选出了一株稳定高产的变异株。原生质体的最优制备条件为：将培养至15 h的细胞添加1 g.L^-1甘氨酸和0.3 U.L^-1青霉素培养2 h后,37℃下,2×10⁴ U.L^-1溶菌酶作用8 h脱壁。经平板计数,原生质体形成率可达99.82％,原生质体再生率达10.12％。采用⁶⁰Co-γ射线进行辐照诱变,当辐照剂量率5 Gy.min^-1,辐照剂量为500 Gy时,原生质体致死率可达99.3％。经反复筛选,获得一株丁醇高产菌株R₃,该菌具有较高的遗传稳定性。在P₂半合成液体培养基中,37℃下静置培养72 h,总溶剂产量较出发菌株提高81.46％,丁醇产量提高85.41％。     

赤霉素产生菌原生质体理化诱变-定向筛选模型的建立与应用

针对赤霉素工业生产菌株皆为不产生孢子的多核多细胞菌丝型,通过酶解手段溶去赤霉素菌丝体的细胞壁,使其成为单一游离的原生质体,在此基础上建立赤霉素产生菌原生质体抗药性致死突变标志诱变筛选模型,以解除高浓度反应底物及内源赤霉素对其产生菌生物合成的反馈抑制和阻遏,提高赤霉素生物合成酶的活力,从而获得赤霉素高产菌株。应用所建立的赤霉素诱变筛选模型,进行产生菌原生质体理化诱变-定向筛选,成功得到N7298等多株原生质体再生的抗药性突变高产菌株,其摇瓶效价比出发菌株N提高23.4%,在20m3罐生产水平提高24.1%。     

高温煤气脱硫剂再生性能研究进展

金属复合型脱硫剂已经成为高温煤气脱硫剂的研究重点,脱硫剂不仅要求具有良好的硫化能力,还必须易于再生,以达到多次循环使用及降低生产成本的目的。介绍了中高温煤气脱硫剂的再生性能的研究概况,包括:铁和锌系列脱硫剂、钙和铈系列脱硫剂、铜和锰系列脱硫剂。大量实验研究表明,脱硫剂的种类和再生工艺与其再生后的脱硫特性密切相关,再生结果是脱硫剂能否工业化应用的关键环节之一,在考察脱硫剂硫化特性的同时,必须注重脱硫剂再生特性的研究。     

吸附-氧化再生法处理印染废水的试验研究

以印染废水为处理对象,以D301大孔树脂为吸附剂,选取次氯酸钠溶液为再生氧化剂,对吸附-氧化再生法处理印染废水的可行性及其影响因素进行了试验研究。结果表明:D301大孔树脂对印染废水有较好的吸附性能,其COD平衡吸附量可达166.2mg/g;当吸附剂再生时间为20min时,COD再生率可达83.8%。以D301大孔树脂为吸附剂、次氯酸钠溶液为再生氧化剂的吸附-氧化再生法处理印染废水具有处理时间短、操作灵活的优势,吸附剂的氧化再生时间短、再生率高,有很好的可行性和良好的应用前景。     

Protoplast from <Emphasis Type="Italic">β</Emphasis>-carotene-producing fungus <Emphasis Type="Italic">Blakeslea trispora</Emphasis>: Preparation,regeneration and validation

The effects of key parameters on the preparation and regeneration of protoplast from the β-carotene-producing fungus Blakeslea trispora were discussed in this paper, including the combination of various enzymes, mycelial age, digesting time and temperature, pH value, osmotic stabilizers, pretreatment, culture medium and culture method. Under the condition of mixed enzymes in osmotic stabilizer (0.6 M NaCl) combined with 2% lysozyme, 3% cellulase and 3% snailase, the highest protoplast yield, as high as 7.48×106 protoplasts/mL, was obtained when mycelial age was 60 h at pH 5.0–6.0 with digesting for 14–16 h at 28 °C. After purification of the obtained protoplasts, they were regenerated in PDA regenerative medium using bilayer plate culture method. To validate the usability of the protoplasts, a novel plasmid with green fluorescent protein (GFP) was used in transformation for easy visual observation. The results showed that the protoplasts prepared by the optimized method were active and applicable in further gene manipulation experiments. This work was presented at 13 ^th YABEC symposium held at Seoul, Korea, October 20–22, 2007.