天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化

目的优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽。方法采用单因素试验和L(934)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响;用5 L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略。结果影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度>起始pH值>甲醇添加量>诱导时间,最佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5%、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH 7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12 h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平;高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白。结论优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺,为其规模化生产奠定基础。方法以目的蛋白的表达量及菌体浓度作为综合评价指标,对重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的摇瓶发酵温度、初始pH值、溶解氧、IPTG浓度及诱导时间进行优化;以摇瓶发酵结果为基础,进一步对发酵罐培养工艺中诱导时机、诱导时间及补料培养基配方进行优化;以确定的罐发酵工艺条件连续发酵5批,验证该发酵工艺。结果最适摇瓶发酵工艺条件为:发酵温度为37℃,初始pH值为7.0,高溶氧,IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为4 h;最适罐发酵工艺条件为:菌体A600值约为40时开始诱导,诱导时间为4 h,补料培养基配方为葡萄糖25%,MgSO4.7H2O 0.5%。按照确定的工艺连续发酵5批,最终菌体A600均达50.0以上,目的蛋白的表达量均高于15%。结论优化的重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺稳定性良好,已达到中试生产规模的要求。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。     

毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

大孔离子交换树脂在重组大肠杆菌生产hEGF中的原位分离作用

引　言乙酸是重组大肠杆菌培养过程中的主要代谢副产物[1,2 ] ,乙酸的产生和积累对重组菌的生长和外源蛋白表达都有严重的抑制作用[3,4 ] .许多研究者对此开展了多方面的研究 ,如通过代谢工程手段构建乙酸酶缺陷菌株作为宿主菌来减少乙酸的产生[5] 、采用发酵 /分离耦合技术除去或降低乙酸量[6～ 8] 、透析培养技术[9,10 ] 、控制菌体的比生长速率及限制基质葡萄糖浓度等方法 .　　　本实验室开展了重组大肠杆菌分泌性高效表达人表皮生长因子 (humanepidermalgrowthfactor ,hEGF)的研究 ,发现在重组菌培养过程中乙酸的积累对重组菌生长和hEGF表达有严重抑制作用 .本文开展了高效吸附乙酸的离子交换树脂筛选 ,并在摇瓶和发酵罐规模两个水平上研究离子交换树脂在重组大肠杆菌发酵生产hEGF过程中对乙酸的原位分离作用 .1　材料与方法1 1　菌株与质粒E coliJM10 1/pSP10 3,本研究所保存的高效分泌型hEGF的重组大肠杆菌 .1 2　培养基及培养方法种子培养基和发酵培养基 ,种子培养、摇瓶培养及 2 5LB Braun发酵罐培养的条件参照文献[11],其中发酵培养基中...     

重组柠檬酸杆菌合成紫色杆菌素的工艺条件优化

以L-色氨酸为前体物,对弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)基因工程菌株生产紫色杆菌素的工艺条件进行了优化。通过单因素实验研究了培养基种类、培养温度、碳源、溶氧、种子液的状态、接种量、诱导时机、诱导剂的浓度及初始pH对细胞生长和紫色杆菌素产量的影响,通过正交实验研究了这些因素中可能存在交互作用的4个因素(种子液OD660、接种量、诱导时机、诱导剂浓度)的影响主次,确定了这些因素、水平的最佳搭配方案。结果表明,重组柠檬酸杆菌合成紫色杆菌素的最优培养条件为:种子液培养至OD660=3.6时,以3%的接种量接种于以甘油为碳源、初始pH为6.5的磷酸盐发酵培养基E2(25μg.ml-1卡那霉素),先在37℃、200r.min-1下培养至OD660=1.4,然后加入0.5μl.ml-1的诱导剂正辛烷,同时转入20℃,在150r.min-1下诱导培养31h。在此最优条件下,紫色杆菌素粗提物(紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素的混合物)产量可达1.809g.L-1,比优化前(0.514g.L-1)提高了252%,是目前国际上其他研究小组报道的最高摇瓶产量(0.43g.L-1)的4.2倍。质粒稳定性实验结果表明重组柠檬酸杆菌在抗生素选择压力条件下具有良好的遗传稳定性。     

密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵

目的　研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件。方法　将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子 ,人工合成hEPO全基因 ,然后将其插入表达载体PBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选构建正确的PBV2 2 0 hEPO DH5α菌落 ,经升温诱导 ,SDS- PAGE和Westernblot鉴定表达产物 ;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响。结果　经酶切分析 ,DNA测序鉴定 ,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中。通过高密度发酵培养 ,最终菌体密度达A6 0 0 =30 (相当于菌体 35g L) ,hEPO表达量达 30 %左右。结论　人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达 ,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件。     

表达人肝细胞生长因子突变体——NK4工程菌的发酵工艺研究

目的　建立重组NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法　采用锥形瓶、发酵罐发酵 ,对工程菌生长和表达条件如pH、诱导时间及诱导剂浓度等方面进行优化。确定其最佳诱导表达条件 ,在 15L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果　在 15L发酵罐进行工程菌发酵 ,菌体收获量湿重可达 2 4 .6g L± 0 .98g L ,目的蛋白的表达量保持在菌体总蛋白的 5 0 %左右 ,发酵时间为 11h。结论　建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。     

用毕氏酵母表达蛇岛蝮蛇毒类凝血酶发酵条件的优化

为了提高大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶的表达量 ,利用 5 0 0ml摇瓶培养体系研究了在不同培养基、pH值、发酵时间等培养条件下分泌蛋白的浓度及活性 ,使发酵条件得到优化 :丰富培养基比营养缺陷型培养基更利于目的蛋白的分泌表达 ,发酵优惠条件 pH值为 6 0 ,时间为 36h ,发酵液上清能检测到靶酶的酰胺水解活性。类凝血酶的表达量约为 4mg/L。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。