中性内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

中性内切-β-葡聚糖酶在棉织物生物整理方面具有重要的应用价值,研究首先从特异腐质霉(Humicola insolens)菌株中克隆到一个中性内切-β-葡聚糖酶基因,将该基因置于里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶I强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PHT。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PHT导入里氏木霉的分生孢子中,进一步筛选得到八个重组里氏木霉转化子。摇瓶发酵培养72 h时,发酵液的中性内切-β-葡聚糖酶活力最高可达到98.8 IU mL 1左右,是出发菌株的5.1倍。研究成功地实现了外源中性内切-β-葡聚糖酶在丝状真菌里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果将在牛仔布水洗工业中发挥出重要作用。     

利用强启动子对纤维二糖酶基因在里氏木霉中进行异源表达

为提高里氏木霉中纤维二糖酶的表达量,构建了含有不同强启动子的纤维二糖酶基因重组质粒,以根癌农杆菌介导的方法将表达元件整合到里氏木霉基因组中,获得了高效表达纤维二糖酶基因的里氏木霉优势菌株。采用反转录的方法从黑曲霉RNA中克隆得到纤维二糖酶基因(cb)的编码序列,并以启动子Pcbh1和Pxyn1控制cb基因的表达,通过根癌农杆菌介导转化,成功将表达元件整合到里氏木霉基因组中。通过对不同启动子控制下的阳性转化子进行发酵筛选,纤维二糖酶活性最高比对照分别提高了376%和323%。通过水解纤维素实验,重组菌株表达的纤维素酶能更好的对纤维素进行水解,水解率比对照菌株分别高出了29.73%和26.78%。该研究成果对解决里氏木霉表达纤维二糖酶低的问题具有一定的指导意义。     

一种新型内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可产生一种耐热、耐碱的新型内切-β-葡聚糖酶(EGL1),具有重要的工业应用价值。鉴于野生型刺糙青霉的产酶水平低,将该菌的内切-β-葡聚糖酶基因经过密码子优化后,在里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行重组与表达,采用里氏木霉强启动子Pcbh1(纤维二糖水解酶Ⅰ)及其信号肽,以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PET,并采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PET导入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上筛选获得5个优良的重组转化子。将5个转化子重复传代培养10个批次后,分别提取染色体DNA进行PCR验证,均可检测到目的基因Egl1n(密码子优化后的Egl1)条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。采用SDS-PAGE蛋白电泳对转化子培养液进行检测,获得了与目的基因表达产物相符的蛋白条带(约41 kDa),表明Egl1n已在重组里氏木霉中成功实现了胞外表达。重组转化子在30℃,摇瓶转速200 r×min~(-1)条件下培养48 h,取发酵上清液在pH 8.0,60℃条件下,测得内切-β-葡聚糖酶活力为382.6 U×mL~(-1),是出发菌株的22.5倍。酶学性质研究结果表明:该酶耐热性能较好,在70℃以下性能稳定,其最适催化温度为60℃;该酶在pH 5.0~10.5稳定性较好、具有明显的催化活性,其最适pH为8.0,属于碱性纤维素酶。从而成功地实现了刺糙青霉内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果在里氏木霉纤维素酶的定向进化及其工业化应用中具有重要的促进作用。     

厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达

里氏木霉(Trichoderm reesei)是重要的纤维素酶生产菌,为了显著提高其产酶性能,拟利用分子生物学技术构建高产的基因工程菌株.将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因af2置于里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,...     

黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆及其在里氏木霉中的表达

里氏木霉(Trichodema reesei)是目前常用的纤维素酶生产菌种,其分泌的纤维素酶是一个多组分的复合体系,主要包括5种内切型-β-葡聚糖酶(endo-J3-glucanase,EG,EC3.2.1.4),两种外切型β-葡聚糖酶(exo-β-glucanase,EC3.2.1.91,也称纤维二糖水解酶cellobiohydrolase,CBH)和两种纤维二糖酶(cellobiase,EC3.2.1.21,也称β-葡萄糖苷酶β-glucosidase)[1-3].在里氏木霉的纤维素酶蛋白中,纤维二糖水解酶I(CBHI)受强启动子控制,其蛋白质比例最高,约占50%～60%[1],而纤维二糖酶(CB)的比例最低,只占1%左右[4].     

重组里氏木霉产漆酶及其在含活性艳蓝KN-R印染废水脱色中的应用

由血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)产生的漆酶耐热性能良好,具有重要工业应用价值,但该菌的产酶性能低,不适于规模化生产。研究将该漆酶基因进行密码子优化后,与里氏木霉(Trichoderma reesei)强启动子Pcbh 1、终止子Tcbh 1和潮霉素抗性基因连接得到重组质粒pCH-lac,再通过农杆菌介导技术,将此质粒转化到里氏木霉细胞中,通过潮霉素抗性筛选及复筛得到9个重组转化子。摇瓶产酶试验显示:发酵液中漆酶活力在补料培养至第7天可达20.3IU×mL~(-1),表明外源漆酶基因已在里氏木霉宿主中成功实现了高效表达和胞外分泌。重组转化子所产漆酶对含活性艳蓝KN-R的印染废水具有明显的脱色作用:在漆酶用量为0.7 IU×mL~(-1)、60℃、pH 3.6,且不加任何介体条件下,反应5 h脱色率可达到91.0%。该研究成果对于促进漆酶的规模化生产及其在环境治理方面的应用具有重要意义。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶(C1)高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C1酶活力可达18.24 U·ml-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明:重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·(g底物)-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-b-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶（C₁）高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C₁酶活力可达18.24 U·ml^-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明：重组转化子的纤维素酶体系中内切-b-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-b-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力（滤纸酶活力FPA）也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·（g底物）^-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

杨木纤维混菌协同发酵产还原糖

为提高杨木纤维的糖化利用率,采用酸处理的方式制备杨木纤维还原糖,对硫酸浓度、水解时间和液料比分别进行单因素试验,根据单因素实验结果设计Box-Behnken中心组合试验,以还原糖提取率为指标值,采用响应面分析法确定降解的最优工艺参数。并以混合培养纤维素生产菌的方式提高纤维素酶的生产量酶解杨木纤维产还原糖。结果表明:酸预处理过程产还原糖最优化条件为,液料比10.03、酸浓度2.03%、水解时间103 min,还原糖提取率平均值为19.31%。获得能大幅度提升纤维素酶活的菌种比例为斜卧青霉和里氏木霉RutC-30,接种比例为3∶7,酶解得率为21.7%。为后续的木质纤维素应用转化为其它产物提供了支撑基础。     

利用重组里氏木霉高效降解秸秆的研究

秸秆还田对于减少化肥使用量、改善土壤生态环境等具有重要作用。本文采用重组里氏木霉对秸秆进行快速降解研究,结果表明,重组里氏木霉在固态发酵中对湿度(60%～75%)、温度(24～32℃)的适应范围较宽,10%氨水常温预处理可加速秸秆的降解进程。重组里氏木霉在秸秆基质中可迅速生长并分泌纤维素酶、漆酶和木聚糖酶,其中滤纸酶活力(即纤维素酶总活力)第8天开始趋于平稳,最终活力为132.26 IU?g~(-1);内切型-β-葡聚糖酶(CMC酶)、漆酶和木聚糖酶活力在第10天达到峰值,分别为1313.15、8.11和5504.10 IU?g~(-1)。接种后第10天,秸秆纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为77.93%、55.12%和31.52%。重组里氏木霉的秸秆降解率比出发菌株及枯草芽孢杆菌分别提高了45.40%和76.37%。本文的研究结果对于进一步提高秸秆快速降解还田技术,改善生态环境具有重要意义。     

由拟康氏木霉Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株中分离得到的一个新的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(CBH)

对拟康氏木霉 Trichoderma Pseudokoningii S—38菌株在玉米秸粉上生长后得到的粗酶液进行了全组分纯化分离。得到了一个物化和酶学性质与已有的外切葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)CBH(cellobiohydrolase)Ⅰ和Ⅱ性质不同的一个可酶解天然纤维素的组分——CBHX。它不水解 CMC(carboxymethy cellulose)、HEC(hydroxyethyl cellulose)、PNPG(P—nitrophyglucoside)和水杨素,但能水解 Avicel 和磷酸膨胀纤维素,在有内切葡聚糖酶存在时则能水解棉花。与 CBHI 在水解 Avicel 或棉花时无协同作用。相对分子质量为340000,等电点7.0。用微热量计测试表明,它可单独作用于棉纤维的结晶区,但检测不出水解产物。     

纤维素直接发酵乙醇微生物的选育──Ⅲ.里氏木霉与运动发酵单胞原生质体融合的研究

用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂，可使钝化的里氏木霉（Tri－chodermareesei）QM9414的原生质体和运动发酵单胞（Zymomonasmobilis）ATCC29191的原生质球之间可以产生远缘的细胞融合子。融合率可达1．9×10－2融合子能利用羧甲基纤维素为唯一碳源而产生羧甲基纤维素酶和乙醇。羧甲基纤维素酶活性高和乙醇产量高的融合子不稳定。这些融合子的产酶能力很容易大部分丧失，而产乙醇的能力亦很低。而酶活及乙醇产量较低的融合子，可能才是真正的基因重组子。     

植物纤维制备燃料乙醇的关键技术

由于中国人口众多、土地资源紧缺,农林植物纤维是发展燃料乙醇的可靠原料.南京林业大学在日处理原料5 吨、日产乙醇0.8吨的农林植物纤维生产燃料乙醇中试生产线上的研究结果表明,植物纤维经蒸汽爆破预处理后,用里氏木霉制备的纤维素酶进行酶水解,纤维素和半纤维素水解得率达71.3 %.含戊糖己糖的水解糖液经树干毕赤酵母发酵转化,糖利用率为87.2 %,乙醇得率为 0.43 g 乙醇/g消耗的糖,生产成本为每吨乙醇4000元左右.为使该技术形成生产力,有待解决的关键技术有:1)能耗低、损耗少的原料预处理技术,特别是蒸汽爆破预处理技术的研究;2)纤维素酶活力高、酶系结构合理的纤维素酶制备和酶水解技术,包括纤维素酶制备基因工程菌的构建,纤维素酶制备的定向调控,高β - 葡萄糖苷酶活力纤维素酶的合成,以及高糖化率纤维素酶水解模式和技术方法;3)戊糖代谢的研究,包括戊糖代谢调控发酵的研究和戊糖己糖同步发酵微生物基因工程菌株的构建;4)植物纤维资源制取乙醇的关键技术的整合和集成;5)能源木本植物的研究.     

两级超滤部分纯化里氏木霉纤维素酶

研究了里氏木霉纤维素酶超滤过程中pH值的影响,结果显示适宜的pH为7.0。在pH 7.0的条件下,依次用PVDF100超滤膜和PS30超滤膜对纤维素酶粗酶液进行恒体积洗滤方式超滤,以洗出其中的杂蛋白,纯化之后的里氏木霉纤维素酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶分别被纯化了2.1、1.78和1.49倍,而且维持了里氏木霉纤维素酶系构成的稳定性。此时,相应酶组分的回收率分别为75.9%、81.8%和54.0%。     

纤维素酶的液体发酵

用液体发酵对11株纤维素酶产生苗的产酶时间和水平进行了比较，两株里氏木霉、两株康氏木霉和一株土曲霉产纤维素酶活力较高，试验菌株的产酶高峰期除EBGA为8．5天少，其余酶均在11．5天以上。对产酶活力较高的两株菌进行了诱导底物和添加物试验，结果表明，未处理过的一些木质纤维素（稻草粉、麦秸粉和玉米芯粉等）对康氏木毒有明显的作用，稀土微肥在实验条件下没有明显的效果。     

碳源和氮源对纤维素木聚糖复合水解酶合成的影响

以富含纤维素和半纤维素的农副产物玉米芯为发酵底物,以实验室中绿色木霉为产酶菌种纤维素,进行木聚糖复合水解酶的诱导合成研究。结果表明:碳源和氮源种类、浓度及碳氮比等因素对纤维素酶和木聚糖酶的合成都有影响。合成的最佳条件是以经过1%NaOH预处理的玉米芯为主要碳源和诱导物,碳源浓度为20 g/L,利用蛋白胨+硫酸铵+尿素为复合氮源,控制碳氮比为5.6。     

里氏木酶利用预处理小麦秆生产纤维素酶的应用研究

为了降低里氏木霉生产纤维素酶的成本,研究了小麦秸秆经白腐菌和酸处理后主要成分如纤维素、木聚糖、木质素含量的变化,采用正交实验考察了里氏木霉菌发酵小麦秆生产纤维素酶的最佳条件,研究得到的最佳条件为:小麦秆∶麸皮=2∶3,培养温度30℃,起始pH 5.0,发酵时间48 h。通过对正交实验条件的优化,发酵液滤纸酶活(FPA)为6.11 IU.mL-1,羧甲基纤维素酶活(CMCase)为29.11 IU.mL-1,纤维二糖酶活(CBA)为16.11 IU.mL-1。和原工艺相比FPA、CMCase和CBA分别提高了30.78%、26.82%和37.11%。     

柄篮状菌与里氏木霉酶解棕榈纤维效果的比较

以青霉属柄篮状菌和里氏木霉Rut-C30为研究对象,在50 IU/g底物酶用量的条件下,比较研究了这两种菌株各自对棕榈空果串纤维的酶解能力。结果表明,柄篮状菌对纤维素的酶解能好于Rut-C30,96 h后,两者葡萄糖转化率为83.7%、61.7%。Rut-C30对木聚糖的酶解能力相对较好,其木糖转化率为98.3%,而柄篮状菌酶解的木糖转化率仅为33.1%。将两菌株的酶按1∶1酶用量混合后,棕榈纤维的整体水解效果增强,葡萄糖、木糖转化率依次为91.3%和98.1%。该研究为柄篮状菌与木霉混合水解棕榈纤维提供了依据。     

里氏木霉QM9414尿嘧啶缺陷型转化体系改进和β-葡萄糖苷酶的过量表达

里氏木霉是广泛应用于纤维素酶生产的工业真菌,但高产突变株遗传操作困难,限制了菌种改良。首先利用定点整合策略敲除里氏木霉突变株QM9414的pyr4基因,成功构建尿嘧啶营养缺陷型菌株QP4,其遗传转化效率显著提高,而且产酶能力不受影响。进一步在QP4中过量表达β-葡萄糖苷酶(BGL)基因bgl1,经大量平板显色筛选获得2株BGL活力明显增强的工程菌QPB4和QPB5,其酶活分别提高10.01倍和8.26倍。利用发酵酶液对2种不同预处理的玉米芯底物进行水解糖化实验,结果显示以酸处理玉米芯为底物时QPB4和QPB5的葡萄糖得率比QP4分别提高60.98%和52.44%,而以脱木素处理玉米芯为底物时其葡萄糖得率分别提高80.01%和86.00%。研究表明改进里氏木霉高产突变株遗传转化体系可以显著促进菌株改良,提高糖化应用效果。     

麸皮对里氏木霉Rut C-30产 纤维素酶的促进作用

本研究尝试通过里氏木霉Rut C-30添加适量的麸皮以及利用实验设计软件Design-Expert寻找适宜的麸皮与微晶纤维素的配比来研究麸皮对里氏木霉Rut C-30产纤维素酶的影响.结果表明,适当的麸皮添加量能够促进纤维素酶的生产;通过二元二次正交旋转组合设计,确定了微晶纤维素添加量和麸皮添加量分别为12.23和23.50 g/L的优化产酶条件.此条件下,在250 mL摇瓶中滤纸酶活达到6.383 FPIU/mL,得率系数为521.913 FPIU/g;在.5 L发酵罐中,滤纸酶活为6.80 FPIU/mL,得率系数为556.582 FPIU/g.相比于优化前,优化后摇瓶实验和发酵罐实验中滤纸酶活分别提高了14.24%和1.403%.而纤维素酶的得率系数却分别降低了6.584%和4.005%.分别以酸解杨木残渣和蒸汽爆破杨木浆替代微晶纤维素作为碳源,最终获得最高滤纸酶活1.953 FPIU/mL和1.45 FPIU/mL.