可控式citZ基因纳米盒的设计与研究

DNA分子具有自我识别的特殊能力，DNA折纸术就是利用这一特性进行核酸纳米材料精准设计和组装的一种新技术。研究者可以利用与DNA脚手架链互补的订书钉链，将长链核酸折叠成与预设模型一致的纳米结构。DNA折纸术最早是2006年由Rothemund提出，一直以来，人们利用M13mp18单链线性DNA进行各种纳米图形的自组装。为了寻找更多的核酸材料进行DNA折纸研究，本文以枯草芽孢杆菌（Bacillus. subtilis 168）citZ基因序列为研究对象，采用改进的DAEDALUS软件，引入“锁钥”结构设计，利用“从下向上”的方法使DNA分子进行自组装，设计出三维体积为50.71nm×50.71nm×50.71nm的citZ基因纳米盒，只有遇到可识别的基因和匹配的“钥匙”时，才可能打开盖子，释放盒中的内容物。这种核酸纳米材料还可以通过调节DNA序列长度调节盒子的内部空间，有望成为一种新型的靶向药物运送载体。     

E. coli K-12琥珀酸脱氢酶sdhC基因纳米锥的设计及自组装

采用DAEDALUS软件，以E. coli K-12 MG1655的琥珀酸脱氢酶复合体C亚基编码酶基因sdhC的双链DNA为脚手架链，进行一个边长为17.68 nm的正四面锥设计，并最终通过核酸自组装反应获得了sdhC基因的纳米锥聚合体。利用琼脂糖凝胶电泳、扫描电子显微镜和透射电子显微镜对多组样品进行化学组分和形貌分析，同时利用原子力显微镜液下成像法测定了核酸聚合体的三维尺度。结果表明：DAEDALUS软件设计出的16条订书钉链，确实将624 bp的sdhC双链DNA中的一条链折叠成了平均边长为19.05nm的正四面锥，与预设模型仅相差1.37nm，证明普通基因的双链DNA可以替代M13mp18单链核酸作为DNA折纸的核酸材料，为构建核酸纳米材料提供了一种新方法。     

核糖体展示技术筛选抗呋喃唑酮单链抗体

目的 运用核糖体展示技术筛选高特异性抗呋喃唑酮(furazolidone,FZD)单链抗体，并进行初步分析。方法 提取小鼠杂交瘤细胞总RNA，利用反转录PCR及重叠延伸(splicing by overlap extension,SOE)-PCR技术合成V_H-linker-V_L单链抗体文库。采用TNT T7 Quick for PCR DNA试剂盒对单链抗体文库进行体外翻译及筛选，经过三轮筛选富集目的基因，对目的基因进行原核表达及纯化后，初步分析其特异性及亲和力。结果 获取1株特异性较高的单链抗体FZD-ScFv1,IC₅₀值为13.01 ng/mL，与呋喃它酮、呋喃妥因、氨基脲、呋喃西林及其衍生物之间的交叉反应率均小于1%。结论 利用核糖体展示技术成功获得亲和力较好的单链抗体，该抗体可用于建立ELISA法，为FZD残留量的快速检测提供了新的思路。     

抗HIV—lgp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的在原核细胞表达抗HIV－1gp120单链抗体基因，纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达，对包涵体进行变异性复性处理后，利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化，纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在，最高表达量占菌体总蛋白量的51％，金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体，复性纯化后具有生物学活性。     

DNA折纸术制备纳米结构-研究进展及应用

DNA折纸术是2006年Rothemund提出的一种DNA自组装方法,它通过一条长链DNA(脚手架链)与预设计的短链DNA片段(订书钉链)碱基互补配对,能得到二维图案或者三维立体结构。相对于其他DNA自组装技术,它可控性高,实验要求低,方便快捷,操作简单,成功率高且在建立二维或三维晶体材料方面有着得天独厚的优势。得到的DNA组装体可以作为模板与功能纳米粒子进行组合,也可用来制作有特殊性能的纳米器件,因而其在各个领域都有极大的潜在应用价值。本文主要综述了DNA折纸术的发展、应用以及对DNA折纸技术的展望。     

与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选

目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I+J)人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性。结果重组表达质粒p ET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000。共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合。结论筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础。     

优化I型胶原蛋白的纯化工艺

本文使用0.5mol/L乙酸和胃蛋白酶提取I型胶原蛋白后，结合等电点沉淀法和超滤纯化技术对I型胶原蛋白进行纯化。通过鞣酸沉淀法和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实等电点沉淀可有效除去胃蛋白酶；经超滤纯化后的胶原蛋白紫外光谱检测在235nm处有最大吸收峰；在SDS-PAGE谱图上出现3条I型胶原蛋白特征谱带；采用凯氏定氮法也证实其纯度符合YY/T 1511-2017医药行业标准；通过傅里叶变换红外光谱、圆二色谱法(Circular Dichroism, CD)测定证实胶原蛋白三螺旋结构被完整保留下来。采用等电点沉淀法结合超滤纯化技术，可保证I型胶原蛋白的高纯度及三螺旋结构的完整性。     

治疗性DNA疫苗生产工艺及质量检测的研究

研究了治疗性DNA疫苗的大规模生产工艺.利用硫酸铵沉淀法和超滤技术对发酵菌体的碱裂解液进行预处理,除去发酵液中大量的RNA;然后依次用凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析对DNA疫苗进行纯化;并对最终质粒DNA溶液进行全面的质量检测.结果表明,DNA疫苗总产率可达62%,各项质量指标均符合药用DNA疫苗质量标准.该纯化工艺操作简便、成本低,适用于大规模工业化生产.     

微生物酶分离纯化研究进展

在对常规的微生物酶分离纯化方法如沉淀法、疏水层析、凝胶过滤、离子交换层析及亲和层析等的特点、原理及应用进行介绍的基础上,概述了膜处理技术、免疫纯化技术、双水相体系萃取等新颖微生物酶分离纯化技术。指出常规方法和新颖方法的结合为微生物酶带来了高效的分离纯化效果,开发先进、灵活的蛋白质化学技术分离纯化天然酶、重组酶、人工模拟酶及杂合酶势在必行。     

抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51％,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。     

杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质

目的分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析。方法通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶。SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响。结果经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31000。该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子。该酶的最适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性最高。结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶。     

植物抗氧化肽制备和活性研究方法

植物抗氧化肽因其来源广泛、高效安全在医药、化妆品和饲料领域拥有巨大潜力。其有效制备和分离纯化是研究开发的关键。文中分析了抗氧化肽制备和分离纯化方法,并对其结构鉴定、抗氧化性能和构效关系进行了评价,探讨了其应用和发展前景。前处理、酶种类和酶解条件对多肽的大小和活性均会产生影响;大孔树脂和膜分离技术只能得到粗多肽,通过色谱可获得纯化多肽;多肽的氨基酸组成和结构与其抗氧化活性密切相关。     

含DNA单链结构的功能聚乙烯的制备及其除汞性能

该文制备了一种含DNA单链结构的汞离子吸附材料,并研究了其对水中汞离子的去除能力。在聚乙烯接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯薄膜（PE-g-PGMA）J2,利用接枝链上的环氧基团与氨基的加成反应,将末端被氨基修饰的富含胸腺嘧啶碱基的DNA单链固定于PE表面,得到含DNA单链结构的功能聚乙烯。通过光电子能谱（XPS）分析证明,DNA单链被成功固定在PE基材表面。汞离子吸附实验结果表明,该吸附材料在0．5μg/L以下的低浓度下仍能吸附汞离子。     

离子交换整体柱对纤维素酶的分离与纯化

采用原位聚合法制备了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯型连续棒状整体柱，然后用二乙胺将其修饰为弱阴离子交换色谱柱，用色谱柱对纤维素降解酶进行了分离，并提出分段洗脱纯化纤维素酶的方法。实验结果表明，该色谱柱可以实现对纤维素酶的快速分离，纯化方法切实可行。     

基于滚环扩增技术的DNA水凝胶的设计与制备

DNA水凝胶是DNA分子链在水溶液中交联形成的三维网状结构,是生物技术及新材料领域的研究新热点。由于DNA分子卓越的特异性与可设计性,利用DNA分子形成具有拓扑结构的DNA水凝胶在实现水凝胶可设计性的同时也能具有智能响应性,在药物运输、生物传感等领域展现出广泛的用途,但该凝胶的制备仍然面临成本高昂及成胶效率低下等问题。滚环扩增技术作为一种新型的酶介导等温扩增方式,极大地节省了合成成本,同时也为单链DNA的有效扩增提供了新的方法,将凝胶的制备变得方便快捷,并且在此基础上赋予其独特的性质。本综述主要介绍了近年来基于滚环扩增制备的新型DNA水凝胶,并对其设计理念、形成机理、优势与难点进行讨论。     

Tgo DNA聚合酶的表达、纯化及其扩增性能

目的表达、纯化Tgo DNA聚合酶,并检测其扩增性能。方法采用PCR技术从嗜热古细菌Thermococcus gorgonarius中扩增Tgo DNA聚合酶基因,并克隆至含His-Tag靶序列的pET101载体中,转化E.coliBL21Sta(rDE3),IPTG诱导表达。目的蛋白纯化后经SDS-PAGE分析,并利用标准pfu酶,采用对比法初略测定酶活性;以质粒pUC19为模板,用Tgo酶和pfu酶进行PCR扩增,比较二者的扩增效率,采用改进的蓝白试验法检测Tgo酶的扩增忠实性。结果 PCR扩增的Tgo DNA聚合酶基因大小约2300bp,根据测序获得的基因序列推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的序列一致。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量约为89000,表达量为350μg/gE.coli,50%甘油保存的酶活性约为5U/μl。Tgo酶和pfu酶的扩增产出率和忠实性均相当。结论成功表达并纯化了Tgo DNA聚合酶,其扩增性能与pfu酶相当。     

肝素钠生产副产物中低分子肝素钠的分离纯化

用制备普通肝素钠过程中含低分子肝素钠的副产物为原料制备低分子肝素钠。先用2%NaCl溶解除去不溶物,用HCl-焦磷酸钠初步除去核苷酸和寡聚DNA,用乙醇沉淀法初步除去小肽和氨基酸,通过D-254离子交换层析法进一步纯化低分子肝素钠。100g副产物可以获得效价为145IU/mg、相对分子质量为的4000～8000D的低分子肝素钠4.67g,纯化了8.5倍,得率为40%,该研究取得了初步成果。     

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

产芽孢梭菌纤溶酶的纯化及特性

目的 从产芽孢梭菌的培养上清中分离纯化出具有纤溶活性的蛋白质。方法 以产芽孢梭菌的培养上清为材料，经过滤、硫酸铵盐析、离子交换层析纯化纤溶酶，并对其理化特性和纤溶活性进行鉴定。结果 所分离纯化的纤溶酶相对分子质量为67000，系由相对分子质量45000和20000的2个亚基组成，具有较强的溶解纤维蛋白的作用。此酶属丝氨酸蛋白酶类，胰蛋白酶类。结论 为纤溶酶的开发和应用提供了依据。     

布鲁菌BP26基因的克隆、表达及纯化

目的克隆布鲁氏菌BP26基因,并在大肠杆菌中高效表达及纯化BP26蛋白。方法提取布鲁氏菌基因组DNA,用PCR扩增出BP26基因,并克隆到pMD18-T载体上,测序正确后,再亚克隆至pET-28a(+)载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经组氨酸结合树脂柱纯化,并对纯化后的表达产物进行Western blot鉴定。结果重组质粒pETBP26经Nde I与Sal I酶切后,可见大小分别为5400和700bp的片段,与理论值相符。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,37℃诱导4h,经SDS-PAGE分析,高效表达出带有His-tag标签的融合蛋白BP26,纯化后的蛋白纯度达96%,经Western blot分析,目的蛋白具有抗原特异性。结论已成功克隆了BP26基因,且表达并纯化了布鲁氏菌BP26蛋白。