人乳铁蛋白异源表达的研究进展

乳铁蛋白（Lactoferrin,lactotransferrin,简称LF、LTF）是一种天然的、具有免疫功能的糖蛋白,1938年Sorensen M和Sorensen SPL首次从牛乳中分离出牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin,简称BLF）;1960年Groves从人乳中首次分离出人乳铁蛋白（human lactoferrin,简称HLF）。由于人乳的来源有限,不可能通过直接提取的方法来生产人乳铁蛋白,所以目前研究较多的是通过基因重组的方法进行异源表达。     

重组人生长激素的分离纯化及其结构确证

目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rh GH)进行分离纯化,并进行结构确证。方法取rh GH工程菌菌体,进行初步纯化(低渗抽提法、盐析法)及层析纯化(Sephadex G-25分子排阻层析、DEAESephadex.F.F离子交换层析、Phenyl-Sepharose.F.F疏水层析、Phenyl S-100HR分子排阻层析),收集纯化产物,进行15%SDS-PAGE分析、相关蛋白含量检测、高分子蛋白含量检测,并进行分子量检测、氨基酸组成分析、N-末端氨基酸序列分析、C-末端氨基酸序列分析和等电聚焦电泳。结果纯化产物的相对分子质量22 125,纯度可达99.5%以上,rh GH蛋白总收率为13.36%,相关蛋白含量为1.55%,高分子蛋白含量低于0.1%;相对分子质量、氨基酸组成、N-末端氨基酸序列、C-末端氨基酸序列及等电点等均与rh GH国际标准品一致。结论纯化后获得了高纯度的rh GH蛋白,该纯化工艺简单、高效,为本产品的工业化生产奠定了基础。     

重组人睫状神经营养因子纯化工艺的建立

目的建立适于生产应用的重组人睫状神经营养因子(recombinant human ciliary neurotrophic factor,rh CNTF)纯化工艺,并对纯化产物进行鉴定。方法将CNTFnew CC22突变体工程菌BL21(DE3)菌体破碎上清经25%饱和度硫酸铵沉淀后,沉淀上清先后经Butyl HP疏水层析和Q HP阴离子交换层析进行纯化。通过非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)检测样品纯度;质谱法测定rh CNTF的相对分子质量;Edman化学降解法测定rh CNTF的N-端氨基酸序列;TF-1细胞/CCK-8比色法和对饮食诱导性肥胖(diet-induced obesity,DDIO)大鼠的减肥作用分别测定rh CNTF的体外和体内生物学活性。结果纯化后rh CNTF的纯度可达99.6%,纯化回收率为34.5%;相对分子质量为21 153;N-端15个氨基酸序列为Ala-Phe-Thr-Glu-His-Ser-Pro-Leu-Thr-Pro-His-Arg-Arg-Asp-Leu;生物学比活性高于2×106 IU/mg,并能有效降低DIO大鼠体重。结论经3步纯化成功获得了高纯度的rh CNTF,为进一步对其性质、功能和生产应用研究奠定了基础。     

重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性

目的在昆虫细胞中表达重组人β-神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβ-NGF),并对表达产物进行纯化和生物学活性鉴定。方法构建rhβ-NGF杆状病毒表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF],利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中,用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞,大量收获含目的蛋白的培养上清,利用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过鸡胚背根神经节培养法检测rhβ-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF]经测序证实构建正确;重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约14 200的单一条带,纯度大于98%,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合,并能刺激神经节突起生长,其比活性约为600 000 AU/mg。结论成功在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF,为其大量制备奠定了基础。     

重组汉逊酵母表达的HBsAg纯化工艺中内毒素的去除效果

目的分析重组汉逊酵母表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)各纯化工序样品中内毒素的去除效果。方法采用鲎试剂法检测重组汉逊酵母表达的HBsAg小量工艺探索、中量工艺验证、中试纯化工艺中破碎细胞、微滤、超滤、硅胶吸附、层析、除菌过滤各工序样品的内毒素含量,计算内毒素去除率,分析各纯化工序与内毒素去除率的关系,并以重组酿酒酵母表达HBsAg各纯化工序中样品作为对照。结果重组汉逊酵母表达的HBsAg纯化过程中内毒素含量由细胞破碎样品的241 EU/ml以上降至除菌过滤样品的1.0 EU/ml以下。微滤和超滤样品内毒素去除率平均可达56%和86%,占总体纯化工艺中内毒素去除率的90%以上。结论重组汉逊酵母表达HBsAg纯化工序微滤、超滤和疏水层析均可有效去除内毒素,以超滤去除内毒素效果最明显,为重组汉逊酵母纯化工艺去除内毒素的研究提供了技术参数和实验依据。     

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。     

牛乳铁蛋白肽在酿酒酵母中的分泌表达及其活性

目的在酿酒酵母中分泌表达牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin,LfcinB),并检测其活性。方法根据LfcinB的氨基酸序列,按照酿酒酵母密码子偏好性设计LfcinB基因序列,人工合成LfcinB基因,扩增后插入质粒pYES2-α中,构建重组表达质粒pYES2-α-LfcinB,转化至酿酒酵母INVSc1中,半乳糖诱导表达。采用抗生素微生物效价测定法中的管碟法一剂量法检测表达的LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌的抑菌活性。对重组酵母菌的诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度进行优化,并检测重组LfcinB的稳定性。结果重组表达质粒pYES2-α-LfcinB经双酶切和测序证明构建正确;重组酵母菌诱导表达产物可见相对分子质量分别为5 164和4 355的特异蛋白条带,每升工程菌发酵液中目的蛋白含量约为2.878 5 mg;表达的重组LfcinB对大肠埃希菌DH5α和枯草杆菌均有明显的抑菌活性;在诱导温度为26℃、半乳糖浓度为3%的条件下诱导96 h时,LfcinB的抑菌活性最高;重组LfcinB具有热稳定性,且二硫键的存在对其抑菌活性无影响。结论已成功在酿酒酵母中分泌表达了具有活性的LfcinB,为进一步研究LfcinB的生物功能及其应用奠定了基础。     

注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。     

人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制

目的对以PEG沉淀结合离子交换层析制备的人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)的中试纯化工艺进行全程质量控制。方法收集FⅧ中试纯化工艺的样品,采用凝固法检测FⅧ凝固活性、BCA法检测总蛋白含量,计算比活性;采用免疫浊度法检测白蛋白(albumin,ALB)、IgG、纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)及纤维连接蛋白(fibronectin,FNC)含量;采用双抗体夹心ELISA法检测FⅧ及von Willebrand因子(von Willebrand factor,vWF)抗原含量;采用SDS-PAGE及Western blot法分析FⅧ特异性;参考《中国药典》(三部)2010版检测成品中PEG、Tween 80及磷酸三丁酯[tr(in-butyl)phosphate,TNBP]残留量。结果层析去掉了大部分杂蛋白,层析后比活性提高了近20倍,原液比活性达到66.92 IU/mg。PEG沉淀和DEAE层析纯化,基本去除了ALB、IgG、FIB和FNC,仅有少量FⅧ抗原及活性损失,原液主要成分为FⅧ和vWF。DEAE层析洗脱峰样品在相对分子质量约95 000和72 000之间可见一条特异性条带,与FⅧ轻链(相对分子质量80 000)及冻干FⅧ国家标准品条带位置相符。PEG、Tween 80及TNBP残留量均符合《中国药典》(三部)2010版规定的FⅧ质量标准。结论本中试纯化工艺可制备出高纯度、高比活性的FⅧ。     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。     

Effect of Plastic Component of Defromation on Accuracy of Prediction of Functional Properties of Polymeric Materials

Fibre Chemistry - Classical methods for predicting polymeric materials deformation processes are based on numerical solution of governing Boltzmann-Volterra viscoelasticity type of equations, which...     

Calorimetric and Computational Study of Enthalpy of Formation of Diperoxide of Cyclohexanone

A thermochemical rather simple experimental technique is applied to determine the enthalpy of formation of Diperoxide of ciclohexanone. The study is complemented with suitable theoretical calculations at the semiempirical and ab initio levels. A particular satisfactory agreement between both ways is found for the ab initio calculation at the 6–311G basis This set level. Some possible extensions of the present procedure are pointed out.     

壳聚糖脱乙酰度测定方法研究新进展

主要介绍近年来壳聚糖脱乙酰度测定方法研究新进展,概述了双突跃电位滴定法——加酶预处理、光纤折射传感法、拉曼光谱法、库仑滴定法等测定原理与特点,并作出比较,为相关科学研究和工业生产测定方法的选择提供理论参考。     

Semi-empirical equation of state of metals. Equation of state of aluminum

A semi-empirical equation of state for metals is described. Its capabilities are demonstrated by the example of the equation of state for aluminum. New experimental data are presented on the location of the isentrope of aluminum for unloading from the state at p = 229.71 GPa on the shock adiabat to an aerogel (SiO₂) of density 0.08 g/cm³. __________ Translated from Fizika Goreniya i Vzryva, Vol. 44, No. 2, pp. 61–75, March–April, 2008.