乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要。利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adhI基因发生同源重组,得到一株ADHI酶活性降低的工程菌株。发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%。说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。     

乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要.利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adh Ⅰ基因发生同源重组,得到一株ADH Ⅰ酶活性降低的工程菌株.发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%.说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰.     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

酿酒酵母产乙醇脱氢酶发酵条件的研究

选择了一株酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)As2.399,通过单因素和正交实验得到酿酒酵母产乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)的最优发酵条件。结果表明:产ADH的最优培养条件是温度为25℃、pH为5、通气量为250mL、接种量为7%,液体发酵培养中pH对ADH活性的影响最大。      

TPK3基因敲除对酿酒酵母耐受性的影响

酿酒酵母是乙醇发酵时常用的微生物,在发酵过程中会受到高温、乙醇、渗透压、乙酸等胁迫环境的影响.为增强酵母对胁迫环境的耐受,该试验以AY12a为出发菌株,利用胞内同源重组,敲除编码蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)催化亚基的TPK3基因,构建TPK3基因敲除菌株AY12a-2.利用敲除TPK3基因的分...     

酿酒酵母中乙醇脱氢酶双水相萃取与DEAE-32层析纯化方法的比较

比较了双水相萃取和DEAE-离子交换层析对纯化酿酒酵母中的乙醇脱氢酶的效果.实验结果表明,经(NH4)2SO4分级沉淀和DEAE-32阴离子交换层析后,ADH的纯化倍率为4.47倍,回收率为32.15%.经(NH4)2SO4分级沉淀和双水相萃取的酶液,ADH的纯化倍率为10.69倍,回收率为53.36%.双水相萃取方法简单,纯化倍率和回收率优于(NH4)2SO4分级沉淀和DEAE-32阴离子交换层析,可用于乙醇脱氢酶的纯化.     

响应面法优化酿酒酵母乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶酶活检测方法

从酿酒酵母前处理方式方面对ALD和ADH酶活测定条件进行了优化,采用单因素试验对前处理方式进行了分析研究,结果表明破壁时间、超声波功率、超声时间、反应温度和缓冲液pH值对酶活测定值产生一定的影响.通过Box-Behnken中心组合设计和响应面分析法,确定了测定这2种酶的最理想酵母前处理条件,即超声功率420W,超声时间为11min,破碎时间为12min.     

采用基因敲除手段降低啤酒酵母蛋白酶A表达的研究

采用醋酸锂转化法,将一段目的基因转入到酵母体内,破坏酵母PEP4基因的表达。通过对目的基因的扩增和羧肽酶Y酶活检测验证基因敲除情况,并通过传代抗性试验与传代发酵稳定性实验验证突变株遗传稳定性良好。     

酿酒酵母细胞cdc50基因敲除及其转录组测序分析

为探讨cdc50基因对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞功能的影响,该研究以PYM14质粒为模板,采用醋酸锂转化法对野生型酿酒酵母BY4742进行cdc50基因敲除,测定突变菌株Δcdc50生长情况,分别对野生型酵母菌株BY4742和突变菌株Δcdc50进行转录组分析,筛选二者差异表达基因（DEGs）,并对其进行基因本体论（GO）、京都基因与基因百科全书（KEGG）富集分析。结果表明,成功构建酿酒酵母cdc50基因缺失菌株Δcdc50,cdc50基因缺失后酵母细胞形态由圆形变为杆状,培养12 h后菌株Δcdc50相对生长率为1.98%,较野生型酵母BY4742菌株显著降低（P<0.05）。与野生型酵母菌株BY4742相比,菌株Δcdc50的DEGs共有581个,其中271个基因上调,310个基因下调。GO富集分析表明,DEGs主要富集在生物学过程中的氧化还原过程等,分子功能中的氧化还原酶活性、辅助因子结合和跨膜转运体活性等。KEGG富集分析表明,DEGs主要富集于糖酵解/糖异生、脂肪酸降解和碳代谢通路等。     

食醋生产中醋酸菌的乙醇脱氢酶活性研究

本文对醋酸发酵过程中醋酸菌乙醇脱氢酶（ADH）活性与产酸速率,产酸浓度的相关性进行了研究。运用检测发酵过程中ADH活力的变化,可感知菌体的发酵能力。     

基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除

建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。     

啤酒酵母HD34-1乙醇脱氢酶活性的研究

菌株HD34-1是将B.sub的乙醇脱氢酶(ADH)基因转入啤酒酵母HD34而构建的无醇啤酒酵母工程菌株,该菌株的ADH基因受Gal启动子的控制,因此为了考察该菌株ADH基因的表达情况,本研究设计了半乳糖和乙醇的浓度梯度进行发酵试验并测定了相应条件下的的ADH活性,结果表明2%的半乳糖浓度,诱导16h最适宜ADH基因的表达。     

酿酒酵母中的蔗糖转换酶基因(SUC2)研究进展

蔗糖转换酶基因(SUC2)编码蔗糖转换酶(Invertase),通过降解酵母细胞外的蔗糖成果糖和葡萄糖来提供酵母生长所需的碳源,在以蔗糖为主要碳源的培养条件下,蔗糖转换酶对于酵母生长必不可少.因此研究蔗糖转换酶基因序列、转录、调控等对酵母蔗糖代谢具有重要意义.蔗糖转换酶基因的表达受葡萄糖浓度、氧气和其在染色体上的位置等因素的影响.本文就葡萄糖浓度对SUC2表达的影响以及葡萄糖浓度对其表达调控的机制进行了综述,并展望了该基因及蔗糖转换酶在今后的应用和研究趋势.     

酿酒酵母的糖转运机理研究进展

简要概述了酿酒酵母所利用的 3种主要糖 :葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖转运进入细胞机理的研究现状 ,分析了目前存在的问题 ,提出了今后的研究方向。     

里氏木霉bgl1基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

采用cross—over PCR方法将里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的外显子进行体外拼接,成功获得了剔除两个内含子的β-葡萄糖苷酶基因bgl1;进一步构建了重组质粒pYX-tbgl,并在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303—1A中获得表达,得到的转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长。     

BAT2缺失酿酒酵母基因工程安全菌株的构建及其杂交育种

为了获得低产高级醇基因工程安全菌株,首先将带有Cre重组酶编码基因的pGAPZA质粒转入BAT2缺失单倍体突变株A8-B和C22-B中,利用Cre/loxp系统去除G418抗性基因(KanMX),获得酿酒酵母单倍体突变株ΔBAT2a和ΔBAT2α。然后将这2株单倍体杂交成双倍体菌株ΔBAT2,该菌株具有良好的遗传稳定性。以野生菌株AY15和2株单倍体出发菌株为对照,对基因工程安全菌株进行白酒发酵试验,实验结果显示,基因工程安全菌株ΔBAT2与出发菌株相比,CO2失重高,残糖低,乙醇含量高;与野生菌株AY15相比,异丁醇、异戊醇、总高级醇生成量分别降低50.00%、33.40%和30.57%。     

不同酿酒酵母PDEs缺失突变株对磨盘柿果酒抗氧化及挥发性物质的影响

以磨盘柿子为原料,考察野生型及基因型为PDE1/Dpde1、Dpde1/Dpde1、PDE2/Dpde2和Dpde2/Dpde2的环核苷酸磷酸二酯酶基因缺失的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵过程中可溶性固形物、总糖、乙醇体积分数和pH值等基本理化指标,总酚和总黄酮等活性物质以及2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力和总还原力等抗氧化能力的变化;并采用顶空固相微萃取技术与气相色谱-质谱联用相结合的方法,对不同菌株发酵的磨盘柿果酒挥发性物质成分进行比较分析。结果表明,在12?d达到发酵终点,4?株突变体发酵速率均比野生型快,其中Dpde2/Dpde2菌株的发酵速率最快;4?株突变体菌株酿造的磨盘柿果酒中总黄酮含量和抗氧化能力均高于野生型菌株,Dpde2/Dpde2菌株酿造的磨盘柿果酒抗氧化功效最强。PDEs基因缺失菌株与野生型酿酒酵母酿造的磨盘柿果酒中的风味物质种类差异不大,PDE2/Dpde2菌株酿造的磨盘柿果酒中酯类相对含量较高。     

利用淀粉的啤酒酵母工程菌研究进展

简要概述了利用淀粉的啤酒酵母工程菌的构建、外源淀粉酶基因在工程菌中的遗传稳定性及其表达和分泌淀粉水解酶问题的研究现状 ,分析了目前存在的问题 ,提出了今后的研究方向 ,并展望了其应用前景。