重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。     

TRAIL与导向肽融合基因的克隆、表达及其表达产物的生物学活性

目的获得具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白,提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。方法构建TRAIL与导向多肽PEPHC1的融合基因,克隆入质粒pGEM-3zf(-)中进行测序,序列正确后,亚克隆入表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达。结果42℃诱导4h,融合基因得到了表达,SDS-PAGE表明目的蛋白占菌体总蛋白的15%以上,以包涵体形式存在。经包涵体洗涤、变性、复性,并经离子交换层析柱纯化后可得到融合蛋白PE-TRAIL,经体外试验证明具有生物学活性。结论成功克隆并表达了具有生物学活性的与导向肽融合表达的重组TRAIL蛋白。     

重组大肠杆菌的包涵体

包涵体（Inclusionbody）是指细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒。由于其在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体（Refractilebody）[1]。它基本上由蛋白质组成，这些蛋白质一级结构是正确的，但立体构型是错误的。本文所指的包涵体是转化载有目的基因质粒的工程细胞，在某些因素的诱导下，目的基因高度表达，在胞内所形成的难溶性颗粒。运用基因工程技术使许多生物活性蛋白质的基因在异体细胞中获高效表达[2]。人们在用大肠杆菌表达人胰岛素时，发现在对数后期，用扫描电镜观察，工程菌壁上有显著凸起，放大数倍…     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

重组人载脂蛋白A-I_((米兰变体))的复性及纯化

目的　从大肠杆菌中获得载脂蛋白A I(米兰变体 ) 的包涵体 ,对包涵体进行复性、纯化 ,最终获得具有生物活性的载脂蛋白A I(米兰变体 ) 。方法　包涵体以尿素溶解后 ,以疏水层析法复性重组蛋白 ;以离子交换层析对其进一步纯化 ,并对所得的蛋白进行生物活性分析。结果　经复性纯化的蛋白纯度达 95 % ,体外生物活性检测显示其具有生物活性。结论　本法能快速有效地对目的蛋白进行复性、纯化 ,并且有望放大至工业生产规模     

疏水层析法复性重组人γ-干扰素

重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析（HIC）法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol•L^-1下降到2 mol•L^-1,流速为1 ml•min^-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×10⁸ IU•mg^-1.     

青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体的纯化

目的 对青海血蜱重组rHq002蛋白包涵体进行复性及纯化.方法 将重组质粒pET-30a-Hq002转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组Hq002蛋白;超声破碎菌体,收集细胞碎片,用PBS缓冲液和低浓度尿素进行多次洗涤;洗涤后的包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,稀释法进行蛋白复性;用镍离子亲...     

包涵体重组蛋白不同纯化方法的比较

目的 比较切胶、包涵体复性及Ni-NTA亲和层析3种方法纯化包涵体重组蛋白的效果.方法 筛选全长IL-1β与全长IL-1Ra重组质粒(简称IL-1β-1Ra-2重组质粒)及全长IL-1Ra重组质粒的转化感受态菌株[感受态E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)PLysS 及E.coli BL2...     

稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体

对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。     

Pichia酵母表达重组人可溶性TRAIL的纯化与生物活性

目的分离纯化Pichia酵母表达的重组人可溶性TRAIL,并检测其生物活性。方法以Pichia酵母分泌型表达TRAIL,采用硫酸铵沉淀和柱层析纯化可溶性TRAIL蛋白。以SDSPAGE、ESIMS和Westernblot法鉴定其纯度及特异性。以细胞透射电镜、DNALadder和MTT法检测其诱导肿瘤细胞凋亡活性。结果目的蛋白以可溶形式存在,蛋白相对分子质量22000,纯化后纯度95%。Westernblot证实为TRAIL蛋白。电镜、DNALadder和MTT均证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论Pichia酵母表达rhsTRAIL可用柱层析法纯化,并具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。     

人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达

目的为获得高表达人巨细胞病毒 ｇｐ５２蛋白基因的工程菌。方法通过计算机分析,筛选出巨细 胞病毒蛋白ｇｐ５２中优势抗原决定簇,用ＰＣＲ技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插 入表达载体ｐＥＴ２８（ａ）内,转化大肠杆菌ＢＬ２１,经Ｓｅｐｈａｒｅｒｙ１ Ｓ－２００分子筛及Ｎｉ－ＮＴＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ螯合层析进行纯化。结 果获得的工程菌所表达的 ｇｐ５２蛋白片段相对分子质量约为 ２１ ０００,约占菌体可溶性蛋白的 ２８％。获得的表达蛋 白纯度达９５％,电泳显示单一条蛋白带,ＥＬＩＳＡ分析证实有较强的抗原性和较好的特异性。结论本研究对人巨细 胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义。     

表达重组人可溶性TRAIL的毕氏酵母发酵工艺

目的优化rhsTRAIL毕氏酵母工程菌在5L发酵罐中的发酵表达工艺参数。方法研究培养基种类、细胞密度、甘油含量、pH值、甲醇浓度、甲醇流加速率及诱导时间等参数对工程菌生长及目的蛋白表达的影响,并用电镜观察其诱导肿瘤细胞凋亡特征。结果在无机盐培养基中,按10%接种A600=8～12的种菌后,24h酵母菌增殖至A600=76;甘油含量为1%时,菌体生长速度快(A600=160);培养基pH值5.0,甲醇终浓度为1%时,诱导96h表达量最高达到120mg/L,并具有诱导肿瘤细胞凋亡特征。结论rhsTRAIL毕氏酵母的发酵工艺参数为无机盐培养基,pH值5.0,接种10%A600=8～12的种菌,甘油含量1%,甲醇终浓度1%,诱导96h。     

重组人白细胞介素-6包含体溶解工艺研究

本文系统研究了影响大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 6 (rhIL 6 )包含体溶解的因素 ,确定了rhIL 6包含体溶解的最佳工艺条件 ,即在 pH为 8 4的 5 0mmol/LTris HCL缓冲体系中 ,变性剂尿素和还原剂 β 基乙醇 (β ME)的浓度分别为 8mol/L和 5 0mol/L ,包含体含量为 1 0mg/mL ,在 4℃下溶解 1h。包含体溶解后蛋白含量可达到 1 3mg/mL左右 ,目标蛋白的溶解率达到 98% ,纯度为 5 0 %左右     

人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达

目的对人内皮抑素(hES)基因进行定点突变,提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法根据Internet网站提供的关于hES的结构信息及其结构与功能方面的研究文献,设计突变位点;利用生物信息学的相关网站,对hES突变体进行结构预测,验证突变位点设计的合理性;采用重叠延伸PCR方法进行hES基因的定点突变,并将突变基因和未突变基因分别亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌中进行融合表达,比较突变前后目的蛋白的可溶性表达量。结果三级结构预测结果表明突变位点设计合理,序列分析结果表明实现了hES基因的定点突变。突变基因的表达产物中,可溶性部分约占总表达量的40%,而未突变基因的表达产物几乎全部为包涵体。结论已成功对hES基因进行了定点突变,突变后的hES可溶性表达量得到了提高。     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)在大肠杆菌中的表达及鉴定

采用RT－PCR技术从LPS诱导的人外周血单核细胞中扩增出人粒细胞集落刺激因子cDNA,将编码成熟序列的cDNA在保证编码氨基酸不变前提下突变并插入到PR启动子下游,使rhG-CSF在大肠杆菌中获得表达。表达产物为包涵体,占菌体总蛋白量的21．4％。纯化产物的比活性可达1．0×108u／mg。     

人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达IL 18。方法　从人外周血中提取RNA ,用RT -PCR方法得到IL 18的cDNA ,双酶切将其插入pET 2 3(b) + 载体中 ,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　所获得人IL 18克隆 ,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS -PAGE显示在相对分子质量 2 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的分子量一致。结论　已成功获得了人IL 18克隆并在大肠杆菌中表达     

人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。