海参乙酰胆碱酯酶的酶学特性研究

对海参乙酰胆碱酯酶(AChE)粗酶的酶学性质进行研究.采用含0.1% Triton X-100 的PBS缓冲液(0.1 M,PH7.4)分别从海参肠和海参体壁中提取 AChE,配合Ellman法测定AChE酶活力.结果表明,海参肠与体壁 AChE 具有相似的酶学性质,其最适反应 pH 值为8.0,pH在6～8时稳定;最适反应温度为35℃左右,在25～45℃内热稳定性较好.海参乙酰胆碱酯酶粗酶液能有效水解碘化硫代乙酰胆碱(AcSChI),但对碘化硫代丁酰胆碱(BuSChI)的作用较弱.当底物AcSChI浓度大于50 mM时产生明显的底物过量抑制效应.金属离子 Sn<'2+>、Zn<'2+>、Hg<'2+>、Ag<'+>、Cr<'6+>、Cu<'2+>及毒扁豆碱和BW284c51均对海参肠和海参体壁乙酰胆碱酯酶有不同程度的抑制作用.     

鲫鱼乙酰胆碱酯酶酶活测定条件的优化研究

在单因素试验的基础上,选定保温时间、保温温度、pH值三个因素的三个水平进行中心组合试验,建立了淡水鲫鱼脑、肌肉和肝脏乙酰胆碱酯酶（ACHE）酶活的二次回归方程。此模型拟合良好,通过响应面分析得到了酶活测定的优化组合条件。结果表明：保温时间、保温温度、pH值对酶活都有极其显著影响,鱼脑酶活测定的最佳条件为保温时间35min,保温温度32℃,pH7．6。肝脏酶活测定最伟条件为保温时间28min,保温温度30℃,pH7．6。肌肉酶活测定的最佳条件为保温时间31min,保温温度31℃,pH7．6。     

乙酰胆碱酯酶固定化技术研究进展

加强有机磷农药残留监测/检测技术,对保护生态环境、保证食品安全、保障人类健康有着重要而深远的意义。基于电化学方法的乙酰胆碱酯酶(AChE)生物传感器,仪器易于微型化、智能化,为实现现场检测分析提供了可能。生物传感器中酶的固定化技术是研究的核心。本文在总结前人工作的基础上对AChE固定化技术做一综述,并展望了未来该领域研究的发展趋势。     

乙酰胆碱酯酶抑制率法测定氨基甲酸乙酯的研究

本研究以乙酰胆碱酯酶对底物碘化硫代乙酰胆碱进行水解,根据氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶的抑制作用,测定氨基甲酸乙酯。实验发现,经溴水溶液增敏后,显著提高了氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶的抑制率,且其抑制程度与浓度在一定范围内呈线性关系,由此建立了一种快速测定氨基甲酸乙酯的酶抑制法。该法测定氨基甲酸乙酯的线性范围为1~7.5mg/L,相关系数r=0.9972,最低检出限为0.04177mg/L,RSD在1.82%~9.69%之间。该法所用试剂成本低,方法快速简单、条件温和易于控制、所需设备少,易于操作。本文为进一步开发基于酶抑制原理的酒精饮料及发酵食品中氨基甲酸乙酯快速检测方法技术及产品提供了相应的理论和技术支持。     

乙酰胆碱酯酶生物传感器及其研究进展

本实验介绍了乙酰胆碱酯酶生物传感器的基本原理,组成与分类。重点介绍了近年来国内外乙酰胆碱酯酶固定化技术和乙酰胆碱酯酶生物传感器研究进展,并分析了未来乙酰胆碱酯酶生物传感器的发展趋势。     

兔血清乙酰胆碱酯酶用于农药残留速测的最佳条件研究

研究了磷酸缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物、酶量对兔血清乙酰胆碱酯酶(AChE)活力测定的影响,结果表明,供试AChE活力最佳条件是:磷酸缓冲液(pH8.0)3.0ml,显色剂0.6%二硫双对硝基苯甲酸(DTNB)50μl,0.75%酶液(pH8.0)100μl,反应温度35℃,混匀稳定后加入底物1%碘化硫代乙酰胆碱(BTCI)50μl,反应180s后在412nm处测定光密度。在上述条件下,测定表明有机磷杀虫剂丙硫磷(Prothiofos)浓度在0.0125～0.4μg/ml,保育时间5～30min之间与AChE抑制率之间存在良好的相关性,可根据检测需要调整保育抑制时间。本试验结果将为应用兔血清AChE研制、改进有机磷和氨基甲酸酯类农药残留速测卡,实现农产品、食品农药残留快速检测提供重要参考。     

猪脑乙酰胆碱酯酶的分离纯化和性质研究

通过离心、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200层析等步骤,从猪脑中获得电泳纯乙酰胆碱酯酶,该酶比活力和纯化倍数分别为2.05 U/mg和26.97,酶活回收率为11.95%;该酶分子质量为257.30 kD,亚基为66.94 kD;以碘化硫代乙酰胆碱为底物时,酶的最适反应温度为37 ℃,最适pH值为7.4,且在40 ℃以下,pH 6.0～8.0有较好的稳定性;最适底物浓度为4.0 mmol/L,Km为0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+对该酶有强烈的抑制作用,而低浓度Mg2+对该酶有激活作用。     

家蝇乙酰胆碱酯酶基因密码子优化及酶学特性表征

基于密码子通用性及不同物种密码子使用频率差异原则,对家蝇乙酰胆碱酯酶的基因序列进行优化,旨在提高其在毕赤酵母中的表达量,增强其应用前景。将基因序列中的低频密码子更换为毕赤酵母偏好的密码子,同时调整乙酰胆碱酯酶各区段GC含量至45%~55%。将优化的家蝇乙酰胆碱酯酶连接至表达载体pPIC9K并转入毕赤酵母GS115中,摇瓶培养。以改进的Ellman法测定重组家蝇乙酰胆碱酯酶（mdAchE）酶学性质,通过有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组酶mdAchE的生物活性。家蝇乙酰胆碱酯酶密码子优化后在毕赤酵母中实现高效表达,酶活力约8.82 U/mL。抑制试验显示,重组酶mdAchE能够被马拉硫磷等7种有机磷农药,克百威等8种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC15值为1.83×10-15 μg/mL,远远低于其它诸如气相色谱法、生物传感器等方法测得的最低检测限（0.01 μg/mL,4.14×10-6 μg/mL）。本试验结果表明,重组乙酰胆碱酯酶mdAchE在有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测领域具有较大的应用潜力。     

6种茶叶提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性研究

目的 研究6种茶叶提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性。方法 采用改良的Ellman酶促反应来检测乙酰胆碱酯酶的活性, 以乙酰胆碱酯酶的活性为指标, 计算乙酰胆碱酯酶抑制率。结果 6种茶叶均具有不同程度的乙酰胆碱酯酶抑制活性。当萃取物浓度为1 mg/mL时, 宁红茶表现出很强的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 平均抑制率高达64.41%。云台山毛尖和靖安白茶抑制率较高均在50%以上, 分别为56.27%和54.42%。狗牯脑、庐山云雾茶和铁观音抑制率分别为34.53%、29.62%、21.47%。当萃取物浓度下降为0.1 mg/mL时, 萃取物抑制活性有明显下降, 6种茶的平均抑制率均小于30%。结论 6种茶叶中云台山毛尖、宁红茶和靖安白茶有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性, 可为开发相关的功能性食品提供参考。     

鲫鱼乙酰胆碱酯酶性质及对有机磷农药的敏感性研究

以鲫鱼为原料,分别提取鱼脑、肌肉和肝脏乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E),研究其酶学性质及对有机磷农药的敏感性。结果表明,鲫鱼脑ACh E最适反应温度为30℃,最适p H为8.0,米氏常数(Michaelis constant,Km)为0.548 mmol/L;鲫鱼肌肉ACh E最适反应温度为35℃,最适p H为7.5,Km为1.75 mmol/L;鲫鱼肝脏ACh E最适反应温度为30℃,最适p H为8.0,Km为0.406 mmol/L。敌敌畏对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的半数抑制质量浓度(50%inhibition concentration,IC50)分别为1.70,3.55和4.52μg/m L,双分子速率常数(bimolecular rate constant,Ki)分别为7.40、7.21、5.94 L/mg·min;辛硫磷对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的IC50分别为2.45,4.05和9.46μg/m L,Ki分别为10.54,10.11和8.32 L/mg·min;毒死蜱对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的IC50分别为10.89、14.33和17.00μg/m L,Ki分别为7.81,6.85和4.99 L/mg·min。鲫鱼脑ACh E对常用有机磷农药表现出了较强的敏感性,可作为环境中有机磷农药残留监测的指示酶。     

Collagen as the Major Edible Component of Sea Cucumber (Stichopus japonicus)

The body wall collagen of an edible sea cucumber, Stichopus japonicus, was studied with respect to its chemical composition and subunit structure. About 70% of the total body wall protein was accounted for by highly insoluble collagen fibers. The disaggregation with β‐mercaptoethanol, 0.1 M NaOH treatment, and limited pepsin digestion of these collagen fibers resulted in complete solubilization. The solubilized collagen was isolated and characterized; it had 2 distinct subunits, αl and α2, which formed (α1)₂α2 heterotrimers and was rich in glutamic acid when compared with other fibrillar collagens. The unique textural properties of cooked sea cucumber seem to be due to thermal denaturation of the insoluble collagen fibers.     

紫外线诱导海参体壁基因表达的研究

本论文对紫外线(58μW/cm2,30 min)诱导的海参体壁自溶进行了基因表达的研究。采用TRIzol法提取海参体壁中的总RNA,以细胞色素B(Cyt B)为内标,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对组织蛋白酶C(CC)、纤维蛋白原A(FGL)、衰老相关蛋白(SAP)和主要卵黄蛋白2(MYP2)、组织蛋白酶L(CL)、钙网蛋白(Calreticulin)、基质金属蛋白酶14(MMP14)、乙酰胆碱酯酶(Ach E)等29种分子进行基因扩增。结果显示,紫外线照射30 min后,海参体壁组织蛋白酶C、纤维蛋白原A、衰老相关蛋白和主要卵黄蛋白2的基因表达水平显著上调(p0.05),上调水平分别较对照组提高了71.4±44.8%、27.1±18.4%、43.7±21.6%和165.5±122.7%,而组织蛋白酶L、钙网蛋白、基质金属蛋白酶14、乙酰胆碱酯酶等基因表达没有显著变化。这些结果表明组织蛋白酶C、纤维蛋白原A、衰老相关蛋白和主要卵黄蛋白2可能参与海参体壁的自溶过程。     

重组海参溶菌酶N端可溶性表达与抑菌分析

通过对海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)cDNA(Genbank accession no:EF036468)片段的分析,结果发现N端基因区域所对应的蛋白质序列中含有糖苷酶活性。因此利用RT-PCR技术以其为模板,扩增出长度为174 bp的溶菌酶N端(SjLys-N)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-N,再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组SjLys-N的基因工程菌。该工程菌在改造的LB培养基和最适的发酵条件下经IPTG诱导后,表达约23 kD的重组SjLys-N蛋白。此外,它还能以可溶性的形式表达,占总菌体蛋白约46%。经过Western blotting分析,重组SjLys-N在23 kD左右能够与penta-his抗体发生特异性免疫反应,结果表明重组SjLys-N得到正确的表达。最后对纯化后的重组SjLys-N进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌和副溶血弧菌有较高的抑菌活性。上述结果将为进一步研究海参溶菌酶的基因结构与功能之间的关系提高参考。     

刺参体壁胰/类胰丝氨酸蛋白酶的性质及其在自溶中的作用

以刺参体壁中丝氨酸蛋白酶为研究对象,对其部分酶学性质及其与刺参自溶的关系进行研究。采用Tris-HCl缓冲溶液提取、硫酸铵盐析、透析及超滤获得刺参体壁粗酶液。结果显示,以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物时,粗酶液的丝氨酸蛋白酶活力最高;以其为底物,测得该类蛋白酶在pH值为6.2和8.5时呈现较强酶活力峰值,两者最适温度范围均为50～55?℃;Cu2＋、Fe3＋、Pb2＋、Zn2＋强烈抑制该酶的活性,Ca2＋可提高该酶活力;邻菲咯啉、乙二胺四乙酸以及半胱氨酸修饰剂均能够部分抑制该酶活力。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐、苯甲基磺酰氟、Na-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮、(3S)-7-氨基-1-氯-3-磺酰氨基-2-庚酮盐酸盐、大豆胰蛋白酶抑制剂能够显著抑制蛋白酶的活力以及自溶过程中可溶性蛋白、三氯乙酸可溶性多肽的生成。上述结果表明,刺参体壁中存在至少2?种具有一定的金属离子依赖性的胰/类胰丝氨酸蛋白酶,其活性中心或底物识别位点可能有半胱氨酸的参与,该类蛋白酶很可能参与刺参自溶过程中蛋白质的降解。     

海参体壁酸溶性胶原提取及氨基酸组成分析

以海参体壁为原料,采用乙酸溶剂法提取酸溶性胶原。以酸溶性胶原得率为指标,通过均匀设计试验确定了乙酸溶剂法提取酸溶性胶原的优化条件:温度为4℃,乙酸浓度为0.5 mol/L,料液比为1∶1 000,提取时间为72 h,在此条件下酸溶性胶原的得率可达到胶原纤维原料的7.35%(质量分数)。氨基酸组成分析表明,海参体壁酸溶性胶原的甘氨酸(Gly)含量为33.6%,羟脯氨酸(Hyp)含量为7.04%。     

海参酶解液的体外抗氧化活性研究

分别选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶水解海参体壁,以DPPH·清除能力、O2-·清除能力、Fe2+螯合力和还原力为抗氧化指标,研究不同海参酶解液体外抗氧化活性的差异。结果表明,随着水解时间的增加,5种酶解液基本上均表现出酶解液的抗氧化能力先增加后下降的趋势。菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解液的DPPH·清除能力和O2-·清除能力较强;胰蛋白酶酶解液的Fe2+螯合能力最强;而木瓜蛋白酶酶解液的还原力最大。从清除自由基角度上,菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶可作为开发海参抗氧化肽的优选工具酶。      

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

本研究以海参肠为原料,采用p H3.0 50 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6（w/v）的料液比,在4℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适p H为3.0,在p H3.0⁷.0之间稳定性较好;最适反应温度为50℃,在4⁴0℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺和K⁺对该酶有激活作用,而Fe³⁺和Fe²⁺则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。      

刺参不同酶解产物的抗氧化活性分析

为了探究刺参不同酶解产物的抗氧化活性,外源添加了3种蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶）酶解鲜活刺参。测定了不同蛋白酶组的水解度、分子量分布、3种自由基（DPPH∙、O2-∙、∙OH）的清除率。结果表明：空白组水解度随着酶解时间的延长没有明显差异,蛋白酶组的水解度与酶解时间呈正相关关系,不同蛋白酶组水解度高低顺序为,中性蛋白酶>碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶,中性蛋白酶组最高为19.4%,木瓜蛋白酶组最低为16.1%;酶解后大分子量片段减少,<200 u的氨基酸片段增加;碱性蛋白酶组,酶解时间1 h,粗肽得率最高达到64.2%。酶解时间2 h内,蛋白酶酶解后酶解液的抗氧化能力比未处理的样品明显提高,并且与酶解液浓度呈正相关关系;质量浓度为5 mg/mL的中性蛋白酶组（酶解0.5 h）,DPPH∙清除率可达到79.64%;碱性蛋白酶组3 h,∙O2-清除率为49.58%,0.5 h∙OH清除率最高为21.78%。综上所述,在抗氧化活性方面,中性蛋白酶酶解产物在外源添加的三种蛋白酶中效果最好,外源添加蛋白酶是提高刺参蛋白利用率的有效方式。     

酶解刺参内脏蛋白制备抗氧化肽的研究

对刺参内脏所含的内源蛋白酶的性质进行了初步研究,在此基础上分析和比较了利用内源蛋白酶和外源蛋白酶酶解内脏蛋白制备抗氧化肽的工艺。刺参内脏主要含有四种内源蛋白酶,最适pH分别为2.0、5.0、8.0和12.0。以羟自由基和超氧阴离子自由基清除率为指标,比较了内源蛋白酶和八种外源蛋白酶酶解内脏蛋白制备抗氧化肽的效果,结果表明菠萝蛋白酶为最佳用酶;用正交实验L9(34)对其水解条件进行优化,确定最佳酶解条件为:pH7.8、温度35℃、加酶量5.0g/100g、酶解时间1h,在此条件下所得酶解液对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为79.15%和28.57%。      

紫外线诱导刺参自溶氧化损伤及体内抗氧化应答

本研究以活刺参为原料,经紫外线(1.5 W/m2)照射不同时间后,检测刺参体壁和肠中的组织蛋白酶L(CL)、乙酰胆碱酯酶(ACh E)、蛋白质羰基、过氧化氢(H2O2)、caspase-3、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力变化和酸性谷胱甘肽(GSH)的变化。研究结果表明,活刺参经UV照射6 h,体壁和肠中CL活力提高了69.27%、52.37%,ACh E活力下降了55.70%、36.16%,蛋白质羰基量都是对照组的1.30倍左右,H2O2量提高了2.44倍、3.57倍,Caspase-3活力提高了4.09倍、2.81倍,而体壁和肠中SOD、CAT、GPx的酶活随着UV照射时间的延长而降低,分别为38.79%、24.70%,44.27%、36.18%和79.54%、33.79%,GSH含量增加75.31%、66.71%,说明刺参在UV照射下在发生自溶的同时伴随了氧化损伤和细胞凋亡现象,UV诱导的自溶途径中ROS以及相关氧化产物对于刺参自溶起到了作用,研究结果对于丰富海参自溶机理具有一定的意义。