RNA干扰BC047440基因表达对HCT-8细胞增殖能力的影响

目的探讨RNA干扰结肠癌相关基因BC047440的表达对结肠癌细胞HCT-8增殖能力的影响。方法将BC047440基因shRNA干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-BC047440-331(a1)、pGPU6/GFP/Neo-BC047440-451(a2)、pGPU6/GFP/Neo-BC047440-615(a3)、pGPU6/GFP/Neo-BC047440-756(a4)采用脂质体法转染结肠癌细胞HCT-8,荧光显微镜观察转染效率,荧光定量PCR法检测细胞BC047440基因mRNA的表达水平,MTT法分析细胞的增殖活性。结果细胞的转染效率为53%;干扰质粒a1、a2、a3、a4转染的HCT-8细胞BC047440基因mRNA的表达水平分别下降了36.1%、47.0%、53.8%和63.3%,a4质粒的干扰效率最高;细胞的增殖能力也明显下降。结论 BC047440基因RNA干扰质粒可明显抑制HCT-8细胞BC047440基因mRNA的表达及细胞的增殖,可能成为抑制结肠癌细胞生长的新基因。     

小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1真核表达质粒的构建及其RNA干扰靶点的筛选

目的构建小鼠睾丸组织高表达基因mINCA1的真核表达质粒,并筛选其RNA干扰靶点。方法从BALB/c小鼠睾丸组织中扩增mINCA1基因,插入真核表达载体pMSCVpuro,构建重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1,转染人胚肾HEK 293T细胞,转染48 h后,分别采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达。设计并合成针对mINCA1基因的4个RNA干扰质粒,分别与质粒pMSCVpuro-mINCA1共转染HEK293T细胞,采用Western blot法筛选mINCA1基因的干扰靶点。结果 PCR、双酶切及测序结果证实重组真核表达质粒pMSCVpuro-mINCA1构建正确;pMSCVpuro-mINCA1质粒转染的HEK 293T细胞中有mINCA1基因mRNA的转录及蛋白的表达;干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1和PGPU6/GFP/Neo-shRNA3可显著降低mINCA1蛋白的表达量。结论成功构建了mINCA1基因真核表达质粒,并筛选出mINCA1基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究mINCA1基因的功能及作用机制奠定了实验基础。     

shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞株P-gp表达的抑制作用

目的探讨靶向mdr1基因的shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞(K562/ADM)P-gp表达的抑制作用。方法合成靶向mdr1基因的短发夹shRNA表达载体,转染K562/ADM细胞。利用RT-PCR检测转染细胞中mdr1基因mRNA,Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术分别检测P-gp的表达。结果在瞬时转染pSilencerTM3·1-H1neomdr1-A和mdr1-BshRNA表达载体的K562/ADM细胞中,mdr1基因mRNA转录分别减少到39·1%(P<0·05)和30·8%(P<0·01)。Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术检测显示P-gp表达被明显而特异地抑制。结论靶向mdr1基因的shRNA表达载体能够特异而有效地抑制耐药的人红白血病细胞中的P-gp表达。     

肺癌抑癌基因1对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响

目的探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。     

小鼠PARP-1基因RNAi表达质粒的构建与筛选

目的构建并筛选小鼠聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)基因的RNAi表达质粒,为肿瘤基因治疗探索新途径。方法根据GenBank中报道的PARP-1基因序列及shRNA设计原则,设计、合成用于构建RNAi质粒的寡核苷酸,构建4种重组PARP-1RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体LipofectamineTM2000介导转染小鼠Lewis肺癌细胞株。48h后,采用RT-PCR技术检测转染细胞中PARP-1基因mRNA的转录水平,筛选有效的PARP-1RNAi质粒。结果4种重组PARP-1RNAi质粒经酶切及测序证明构建正确。转染后48h,转染质粒pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308和pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1837的Lewis细胞PARP-1基因mRNA的转录水平降低,转染pGPU6/GFP/Neo-PARP-1-1308组下降更明显,以其作为后续实验的有效质粒。结论已成功构建并筛选出PARP-1基因的RNAi表达质粒,为PARP-1基因RNAi治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

小鼠Chk1基因RNAi表达质粒的构建与筛选

目的构建并筛选小鼠细胞周期检测点激酶1(Chk1)基因的RNAi表达质粒,为肿瘤的基因治疗探索新途径。方法根据GenBank中登录的Chk1基因序列及shRNA设计原则,设计、合成用于构建Chk1基因RNAi质粒的寡核苷酸,并构建4种重组Chk1RNAi质粒,酶切及测序鉴定正确后,以脂质体LipofectamineTM2000介导转染小鼠Lewis肺癌细胞株。转染后48h,采用RT-PCR技术检测转染细胞中Chk1基因mRNA的转录水平,筛选有效的Chk1RNAi质粒。结果4种重组Chk1RNAi质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确。转染后48h,转染质粒pGPU6/GFP/Neo-Chk1-536的Lewis细胞Chk1基因mRNA的转录水平下降,以其作为后续实验的有效质粒。结论已成功构建并筛选出Chk1基因的iRNA表达质粒,为Chk1基因iRNA治疗肿瘤的研究奠定了基础。     

5种新疆香阿魏对结肠癌细胞增殖抑制、促凋亡及逆转耐药作用的研究

通过MTT法和流式细胞术检测5种新疆香阿魏(准噶尔阿魏、多伞阿魏、山地阿魏、全裂叶阿魏、荒地阿魏)乙醇提取物对小鼠结肠癌CT-26.WT细胞的增殖抑制及促凋亡作用,并通过MTT法检测5种新疆香阿魏乙醇提取物对人结肠癌耐长春新碱HCT-8/VCR细胞的安全给药浓度及逆转耐药作用。结果发现,5种新疆香阿魏乙醇提取物均对小鼠结肠癌CT-26.WT细胞有增殖抑制作用;全裂叶阿魏、准噶尔阿魏乙醇提取物的抑制作用较好,IC₅₀值分别为20.93 mg·L^-1、22.19 mg·L^-1。全裂叶阿魏乙醇提取物对小鼠结肠癌CT-26.WT细胞有较明显的促凋亡作用,凋亡率达到90.26%。5种新疆香阿魏乙醇提取物均可抑制HCT-8/VCR细胞的增殖,其中逆转耐药作用最佳的是准噶尔阿魏乙醇提取物。表明,全裂叶阿魏、准噶尔阿魏对CT-26.WT细胞的增殖抑制、促凋亡作用较明显,并且准噶尔阿魏对HCT-8/VCR细胞具有较好的逆转耐药作用,准噶尔阿魏、全裂叶阿魏均具有一定的抗肿瘤效果,值得更进一步的深入研究。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

RNA干扰技术对MCF-7细胞Aurora-A基因表达的影响

目的构建针对Aurora-A基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并探讨其对人乳腺癌细胞株MCF-7中Aurora-A基因表达的抑制作用。方法将具有短发夹结构的2条DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGCsi-U6/Neo/GFP中,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行序列测定。并通过脂质体法转染至MCF-7细胞中,48h后观察转染效率,并采用RT-PCR及Westernblot法检测siRNA对MCF-7细胞Aurora-A基因mRNA及蛋白表达的影响。结果测序鉴定证实目的寡核苷酸片段已被克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,Aurora-A-siRNA质粒转染MCF-7细胞48h后转染效率约为60%,与对照组比较,Aurora-A-siRNA质粒转染的细胞Aurora-A基因mRNA和蛋白的表达均明显下降。结论已成功构建了Aurora-A-siRNA真核表达质粒,其能明显抑制MCF-7细胞Aurora-A基因的表达,为进一步研究Aurora-A基因的功能奠定了基础,并可能为肿瘤的生物学治疗提供新的方法。     

人SIAH2基因真核表达质粒的构建及其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响

目的构建人SIAH2基因真核表达质粒,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法采用PCR技术从MDA-MB-231细胞中扩增SIAH2基因全长序列,克隆至表达载体pcDNA-3.1-hisB中,构建重组真核表达质粒pcDNA-3.1-hisB-SIAH2,转染MDA-MB-231细胞,Western blot法检测SIAH2蛋白在细胞中的表达;免疫荧光法检测SIAH2蛋白在细胞中的定位;流式细胞术检测细胞细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖活力的变化。结果重组真核表达质粒pcDNA-3.1-hisB-SIAH2经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)和测序证实构建正确;重组质粒转染细胞后,细胞中SIAH2蛋白的表达水平明显升高(P0.05),且在细胞核内表达,处于S期的细胞比例明显增加;重组质粒转染细胞后48、72和96 h,细胞的增殖活力明显增强。结论成功构建了SIAH2基因的真核表达质粒,并在MDAMB-231细胞中表达了SIAH2蛋白;SIAH2蛋白能明显促进乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,提示其在乳腺癌的发生和进展中发挥了重要作用,有望成为治疗乳腺癌药物开发的新靶点。     

RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响

目的研究RhoC基因沉默对肝癌细胞Bel7402凋亡和迁移的影响。方法以RNAi沉默Bel7402细胞RhoC基因的表达,FACS和RT-PCR检测细胞凋亡和凋亡相关基因水平,细胞划痕损伤和软琼脂克隆形成试验检测细胞迁移和生长特性。结果RNAi组细胞凋亡率明显高于细胞对照组,RNAi组Bcl-2表达水平明显低于细胞对照组,只有RNAi组可检测到Bax基因的表达。两对照组细胞划痕损伤在48h内愈合,而RNAi组则不能修复。RNAi组软琼脂克隆形成能力明显低于两对照组。结论RhoC基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。     

RhoC基因沉默对肝癌细胞增殖的影响

目的构建靶向RhoC基因的RNA干扰(RNAi)载体,并研究RhoC基因沉默对肝癌细胞增殖的影响。方法将合成的寡核苷酸片段克隆入RNAi载体,并转染肝癌细胞,以沉默RhoC基因表达,RT-PCR检测基因抑制效果。绘制生长曲线,检测转染细胞的增殖情况,FCM检测细胞周期变化。结果构建的RNAi载体有效地抑制了肝癌细胞RhoC基因的表达,RhoC基因沉默显著地抑制肿瘤细胞增殖,增殖期细胞百分数显著下降,而静止期细胞百分数显著升高。结论RhoC基因沉默能够抑制肝癌细胞的增殖,为靶向RhoC的肿瘤基因治疗奠定了基础。     

Notch2胞内段基因过表达对K562细胞增殖的影响及其机制

目的探讨外源性Notch2胞内段基因过表达对慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)细胞株K562增殖的影响及其机制。方法将携带Notch2胞内段(ICN2)基因的质粒转染K562细胞,MTT法检测细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞的细胞周期分布;RT-PCR检测Notch2基因全长mRNA的转录,Western blot检测Notch2蛋白的表达;RT-PCR检测Notch通路下游靶基因Hes1、Hey1及细胞增殖、凋亡相关基因numb、Bcl-2、NF-κB和TGF-β1的mRNA转录水平。结果与未转染组相比,转染组K562细胞数量减少,增殖显著受抑(P<0.01);转染48 h后的K562细胞G1期细胞比例显著增多(P<0.01),S期细胞比例显著减少(P<0.01);Notch2基因mRNA及下游靶基因Hes1和Hey1 mRNA转录水平均明显增强(P<0.01),Notch2蛋白表达量增加(P<0.01);numb基因mRNA转录水平无变化;Bcl-2表达下调,NF-κB和TGF-β1表达上调。结论Notch2胞内段基因过表达可抑制K562细胞增殖,其机制可能是通过上调TGF-β1和NF-κB基因表达及下调Bcl-2基因表达,将细胞阻滞于G1期来实现的。     

GINS2基因siRNA真核表达质粒的构建及其对NB4细胞凋亡的影响

目的构建GINS2基因siRNA真核表达质粒,并检测其对NB4细胞凋亡的影响。方法人工合成针对GINS2基因的4组siRNA干扰序列和1组无同源性的序列,测序鉴定后转染低传代人早幼粒细胞系NB4细胞,经G418筛选后,通过QRT-PCR、Western blot检测重组质粒对NB4细胞中GINS2基因mRNA转录水平和蛋白表达水平的影响;流式细胞术检测NB4细胞的凋亡情况。结果 5组重组质粒经测序证明构建正确,4组干扰质粒转染NB4细胞后,细胞中GINS2基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均有所降低,其中干扰组1基因干扰率达50%,蛋白相对表达量为56%;干扰组1细胞凋亡率为32.54%,较正常对照组和NC组明显上升(P<0.01)。结论成功构建了GINS2基因siRNA真核表达质粒,抑制GINS2基因的表达可促进NB4细胞的凋亡,为进一步研究GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。     

Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

目的构建Lipocalin-2(Lcn-2)基因真核表达质粒PL-2,并检测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响。方法利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增Lcn-2基因,克隆入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建重组质粒PL-2。转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基因的表达。将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Westernblot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确。经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达。加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响。结论已成功构建了Lcn-2基因真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋白对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖。