活化蛋白1在高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用

目的观察活化蛋白1(AP-1)在高糖诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的MC3T3-E1细胞分为正常对照组和实验组,实验组包括22.0 mmol/L D-葡萄糖组(高糖组)、P38MAPK-shRNA慢病毒转染组、P38MAPK信号转导阻断剂组、无关shRNA转染组、AP-1抑制剂SP600125组。采用TUNEL和流式细胞术检测细胞凋亡,用EMSA检测MC3T3-E1细胞AP-1的活性。结果与正常对照组相比,高糖组MC3T3-E1成骨细胞P38MAPK表达、AP-1活性、细胞凋亡显著增加。P38MAPK-shRNA慢病毒转染组和P38MAPK信号转导阻断剂组MC3T3-E1细胞AP-1活性较高糖组分别下降57.9%(P<0.01)和45.6%(P<0.05)。AP-1抑制剂组MC3T3-E1细胞凋亡率较高糖组下降39.7%(P<0.01)。结论高糖通过激活P38MAPK增加AP-1活性,诱导MC3T3-E1成骨细胞凋亡,抑制AP-1活性后高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡显著下降。     

3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸对成骨细胞前体增殖和成骨分化的作用

目的观察不同浓度的3,3',5-碘-L-甲腺原氨酸(3,3',5-triiodo-L-thyronine,T3)对小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14 (MC3T3-E1 subclone 14)细胞增殖及分化水平的作用。方法分别给予不同浓度T3干预细胞,培养1、2、3 d后采用CCK8法检测细胞增殖水平;在成骨分化诱导试剂干预7 d基础上,结合上述T3给药,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测各浓度组成骨细胞分化水平,通过实时荧光定量PCR和免疫蛋白印迹(Western blot)法检测各浓度组的成骨细胞标记性基因及蛋白的表达差异。结果在分别干预1、2、3 d后,T3随着浓度增高,对细胞的增殖水平均呈明显上调;而且相同剂量的T3对于细胞增殖呈时间依赖性增强。此外,MC3T3-E1 Subclone 14细胞诱导7 d后,对比于0对照组,低浓度T3(1 nmol/L)对成骨细胞各分化参数均无明显作用,而10、100、1 000 nmol/L的T3对细胞ALP染色,成骨细胞相关基因及蛋白均明显上调,其中以10和100 nmol/L组最为显著。结论 T3对于MC3T3-E1 Subclone 14细胞的增殖和成骨细胞分化均有显著的促进作用。     

雌二醇下调铁对成骨细胞活性的抑制作用

目的了解雌二醇与铁对小鼠原代成骨细胞活性的影响及活性氧(ROS)的作用。方法提取新生小鼠颅骨原代成骨细胞,经差速贴壁法纯化后传代,选取3~4代进行实验,随机分为对照组,枸橼酸铁铵(FAC)组和FAC+17β-雌二醇(FAC+E2)组,分别用2.5μmol/L FAC和10 nmol/L E2干预7 d后收集细胞,用CCK-8法检测各组细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性;荧光定量PCR(Q-PCR)检测成骨相关基因(Runx2、osterix、Bglap、IBSP)表达;荧光酶标仪检测各组ROS水平并在荧光显微镜下观察。结果细胞活性氧水平检测结果显示,FAC组活性氧水平明显高于其余各组,FAC+E2组与FAC组相比ROS水平降低(P<0.05);FAC干预后细胞增殖能力及ALP活性明显下降(P<0.05),FAC+E2组细胞增殖能力较FAC组上升(P<0.05),ALP活性上升,但差异无统计学意义(P>0.05);Q-PCR结果显示,与对照组相比,FAC组Runx2、osteorix表达水平明显下降(P<0.05),FAC+E2组与FAC组相比,各基因表达水平均显著升高(均P<0.05)。结论 FAC可能通过升高ROS水平抑制成骨细胞生物活性;雌二醇可能通过清除FAC诱导生成的ROS下调该抑制作用。     

铁离子对人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白表达的影响

目的研究人成骨细胞(hFOB1.19)在不同铁离子状态下RANKL/OPG基因及蛋白的表达。方法成骨细胞株(hFOB1.19)在DMEM/F-12培养基培养传代至第3代后,用不同终浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基中干预24h,用RT-PCR方法和免疫印迹法(WesternBlot)检测干预后成骨细胞的RANKL、OPGmRNA和蛋白表达并计算RANKL/OPG比率。结果RT-PCR检测结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPGmRNA表达比分别为0.56±0.13、0.58±0.01、0.69±0.01、1.84±0.92;Westernblot结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPG蛋白表达比分别为0.82±0.66、0.82±0.64、1.09±0.11、1.25±0.14。统计学分析显示,在mRNA和蛋白水平,100和200μmol/L浓度的枸橼酸铁铵干预后RANKL/OPG比值明显高于对照组(P<0.05),50μmol/L枸橼酸铁干预后与对照组差异无统计学意义。结论不同浓度枸橼酸铁铵可以影响人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白的表达,进而可能影响骨形成和骨吸收。     

牵张应力刺激下Erk1/2在人牙周膜细胞成骨化的作用分析

研究牵张应力刺激下细胞外调节蛋白激酶(Erk)1/2在人牙周膜细胞成骨化的作用,本实验收集行口腔正畸治疗拔除的健康前磨牙,组织块法和消化法原代培养人牙周膜细胞。振幅10%、频率0.5Hz的周期性牵张应力刺激细胞,以不加牵张应力的细胞为对照组;并于牵张应力刺激前分别使用ERK1/2通路抑制剂PD98059处理细胞,ERK1/2显性负性突变体转染细胞。实验结果显示,牵张应力刺激不同时间p-ERK1/2蛋白表达水平均明显提升(P<0.05),其中以刺激1 h、3 h时p-ERK1/2蛋白表达水平最高;ERK1/2蛋白表达水平在牵张应力刺激不同时间差异无统计学意义(P>0.05);牵张应力刺激3、6 h时Runt相关基因2蛋白表达水平明显提升(P<0.05)。加入抑制剂PD98059或ERK1/2显性负性突变体转染后,Runt相关基因2、碱性磷酸酶(ALP)、成骨相关基因骨钙素(OCN mRNA)表达水平明显下调;p-ERK1/2、Runt相关基因2蛋白表达水平明显下调。实验证明,Erk1/2信号通路在牵张应力刺激下牙周膜细胞成功分化中发挥重要作用,Erk1/2被力学刺激激活后可通过上调Runt相关基因2蛋白表达介导成骨相关基因ALP、OCN的表达。     

淫羊藿苷通过激活Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:观察淫羊藿苷骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中的促进作用及其对Notch信号通路的影响。方法:通过对BMSCs细胞进行体外分离培养,将细胞分为对照组与给药组,给药组加入0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1淫羊藿苷分别培养3 d、7 d、10 d、14 d、21 d,测定细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,确定最佳给药剂量。将细胞分为3组,对照组、骨分化诱导组、骨分化诱导+淫羊藿苷处理组(联合组),培育7~21 d后测定ALP阳性染色率,Western blot法检测不同处理后Notch信号通路中Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达情况,RT-PCR法检测淫羊藿苷对Hes1、Runx2 mRNA的影响。结果:与对照组比较,0.1~1.0 mg·L-1淫羊藿苷处理后ALP活性升高较明显,7~14 d内活性均逐渐升高,14 d时活性达到最大值,其中0.4 mg·L-1处理活性最高。因此,选择淫羊藿苷最佳处理质量浓度为0.4 mg·L-1。对照组、联合组在细胞培养7~14 d间,ALP活性逐渐升高,14~21 d活性逐渐下降,第21天ALP活性维持较低水平;诱导组在培养期间ALP活性持续维持较高水平。第7天、第14天,与对照组比较,诱导组、联合组ALP活性升高,且诱导组升高程度高于联合组,差异有统计学意义(P<0.05)。第21天,联合组ALP活性高于对照组、诱导组,差异有统计学意义(P<0.05)。诱导组、联合组ALP阳性染色率均高于对照组,且联合组高于诱导组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,联合组、诱导组Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达量均升高,联合组蛋白表达量明显高于诱导组。RT-PCR结果显示诱导组Hesl、Runx2 mRNA表达量均高于对照组,联合组Hesl、Runx2 mRNA表达量高于诱导组。结论:淫羊藿苷能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并通过上调Hesl、Runx2 mRNA表达以及增加Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达来实现。     

miR-30a抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化

目的:确认miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先用Ad-BMP9处理间充质干细胞C3H10T1/2,通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测早期成骨指标ALP、Western blot和PCR检测晚期成骨指标OPN,茜素红S染色检测钙盐沉积了解BMP9对C3H10T1/2细胞的成骨分化作用,同时用Real-time PCR检测miR-30a在该成骨分化中的变化。然后用BMP9条件培养基分别作用Ad-mmu-miR-30a和Ad-RFP预处理10h的C3H10T1/2细胞,检测早期成骨指标ALP、晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素OPN的表达。最后探讨miR-30a在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中的可能作用机制。结果:Ad-BMP9处理C3H10T1/2细胞5d,7d后,ALP的活性的表达增高;第9d后,OPN的表达增加;第14d后,钙盐的沉积明显增多。而miR-30a过表达后,抑制了这一现象。同时发现过表达miR-30a后,Runx2蛋白水平较对照组下降而mRNA水平基本没有变化。结论:miR-30a可以抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化,其作用机理可能和Runx2相关。     

超滤技术对体外循环心脏瓣膜置换术肺损伤保护的研究

目的:探讨在体外循环心脏瓣膜置换术后肺损伤作用机制及改良超滤联合平衡超滤技术对体外循环肺功能的保护效果。方法:择期行心脏瓣膜置换术患者60例,分为对照组(C)、常规超滤组(D1)、改良超滤联合平衡超滤组(D2)。分别在麻醉后转流前(T1),转流结束时(T2),术后2 h(T3),术后6 h(T4),术后12 h(T5)采集动脉血,应用双抗体夹心ELISA法测定血浆内皮素-1(EF-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6),测定结果用Hct值校正,记录各组体外循环后超滤前、超滤后Hct值和计算肺泡氧合指数(OI)、肺泡-动脉血氧分压差(P(A-a)O2)、肺顺应性(Cstat)。结果:D1、D2组在T2、T3、T4、T5时点OI显著高于对照组C(P<0.05);D2组P(A-a)O2在T3、T4、T5时点较D1组、C组低(P<0.05),D2组Cstat明显高于D1、C组;超滤后超滤组(D1、D2)Hct值较对照组显著增高(P<0.05);D2组EF-1、TNF-α和IL-6浓度在T2、T3、T4、T5时点较D1组、C组明显降低(P<0.05)。结论:复合超滤较单一超滤方法能较好地改善瓣膜置换术患者术后肺功能,降低体内EF-1及炎性介质浓度。     

铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响

目的了解铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响。方法 34℃条件下体外培养人成骨细胞(hFOB1.19),以不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用RT-PCR检测成骨细胞铁调节基因膜转铁蛋白(FPN1)、转铁蛋白受体(TfR)和二价金属转运蛋白1(DMT1)表达的变化;用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察成骨细胞铁离子荧光强度;流式细胞仪检测成骨细胞活性氧(ROS)水平;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;Vonkossa染色法行钙结节染色。结果与对照组相比,FAC干预48h后FPN1mRNA的表达随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性上调,TfR、DMT1mRNA的表达呈剂量依赖性下调(P<0.05);FAC干预48h后成骨细胞铁离子荧光强度剂量依赖性减弱,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);48h后成骨细胞ROS水平随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性升高(P<0.05);FAC干预10d后各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随FAC浓度增高而降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,FAC干预17d后成骨细胞钙结节染色显示矿化面积和钙结节形成随FAC浓度增加而减少。结论铁过载对成骨细胞生物活性有明显抑制作用,其机制可能与细胞内铁离子浓度增加及活性氧水平升高有关。