野生型着丝粒蛋白-E基因沉默对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的利用RNA干扰技术下调野生型着丝粒蛋白E(Wild type centromere protein E,CENP-EWT)基因的表达,观察CENP-EWT基因沉默对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法将HCT116细胞分为空白对照组、空载体转染组和CENP-EWT shRNA转染组,转染48 h后,采用巢式PCR检测细胞中CENP-EWT基因mRNA的转录水平;MTT法检测细胞的增殖活力;Hoechst法检测细胞的凋亡比例;Transwell小室试验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果与空白对照组和空载体转染组相比,CENP-EWT shRNA转染组可有效抑制CENP-EWT基因的转录水平(P<0.05);CENP-EWT shRNA转染组细胞的增殖活力明显下降(P<0.05);细胞凋亡比例明显增加(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.01)。结论 CENP-EWT基因沉默能够抑制人结肠癌HCT116细胞增殖,诱导细胞凋亡,但同时能增强细胞的迁移和侵袭能力。     

RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对HEK293细胞凋亡的影响

目的探讨RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列对人胚肾293(HEK293)细胞凋亡的影响以及干扰素(IFN)在此机制中的作用。方法取对数生长期的HEK293细胞,分为6组,ALU-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU)、pcDNA3.1-293组[瞬时转染空质粒pcDNA3.1(-),作为阴性对照]、Poly I∶C-293组[瞬时转染dsRNA的多聚肌苷胞苷酸(Poly I∶C),作为阳性对照]、IFNβ-293组(加入1.65×104 U IFNβ,作为阳性对照)、空白对照组(未经处理的HEK293细胞)和HBs-293组(瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-HBs),转染后48 h,采用MTT法检测细胞的增殖活性;Cellular DNA Fragmentation ELISA和DNA Ladder法检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR检测细胞中IFNβ基因mRNA的水平。结果瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-ALU能够抑制HEK293细胞增殖,并促使其凋亡,且细胞中IFNβmRNA的水平显著上调。结论 RNA聚合酶Ⅱ转录的ALU序列能够通过激活干扰素系统来诱导细胞凋亡。     

MCPH1基因过表达对人肺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响

目的探讨MCPH1(microcephalin 1)基因过表达对人肺癌A549细胞迁移及侵袭能力的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1(实验组)和pcDNA3.1(-)(阴性对照组)分别转染人肺癌A549细胞,采用Real-time PCR及Western blot法分别检测转染48 h后的细胞内MCPH1的表达;采用细胞划痕试验及Transwell试验分别检测MCPH1过表达对细胞迁移及侵袭能力的影响。结果实验组A549细胞中MCPH1水平明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P均<0.05);实验组细胞迁移及侵袭能力较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 MCPH1基因过表达可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭能力。     

Musashi2对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响

目的探讨Musashi2(Msi2)对白血病K562细胞体外侵袭能力的影响。方法将靶向Msi2基因的si-RNA1、siRNA2及阴性对照序列转染K562细胞,同时设空白对照组(未转染的K562细胞)。实时荧光定量PCR法及Western blot法分别检测K562细胞中Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平;经细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;细胞黏附试验检测K562细胞体外黏附能力;Transwell试验检测K562细胞体外迁移及侵袭能力。结果与阴性对照组及空白对照组比较,Msi2-1及Msi2-2组K562细胞中的Msi2基因m RNA转录及蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),体外黏附、迁移、侵袭能力明显减弱(P<0.05)。结论抑制Msi2的表达可显著抑制白血病K562细胞的体外侵袭能力,本实验为进一步研究Msi2在白血病发生发展中的调控机制奠定了基础。     

MMP-2反义寡核苷酸对人胃癌SGC7901细胞增殖和侵袭能力的影响

目的研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌SGC7901细胞增殖及侵袭能力的影响。方法将不同浓度的硫代磷酸化修饰的MMP-2ASODN转染入人中低分化胃腺癌SGC7901细胞株,RT-PCR法检测细胞MMP-2基因mRNA的转录水平;Transwell试验检测细胞体外迁移和侵袭能力变化;MTT法检测细胞的增殖活性。结果转染MMP-2ASODN后,SGC7901细胞中MMP-2基因mRNA的转录水平显著降低,细胞的体外迁移和侵袭能力受到抑制,且抑制作用随ASODN浓度的增加而增强;而细胞的增殖活性无明显变化。结论MMP-2ASODN可抑制胃腺癌SGC7901细胞MMP-2基因mRNA的转录水平及细胞的体外迁移和侵袭能力,但与胃癌细胞的增殖活性无明显相关性。     

DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨DN-ALK2对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞中ALK2基因mRNA的转录;分别以腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞,并设空白对照组,通过MTT法、平板集落形成试验、细胞划痕试验及Transwell侵袭试验检测细胞的增殖、集落形成、迁移及侵袭能力。结果 MDA-MB-231细胞中内源性表达ALK2。腺病毒DN-ALK2和RFP感染MDA-MB-231细胞36 h后,荧光表达量一致,约为70%。MDA-MB-231/DN-ALK2细胞中高表达DN-ALK2。与MDA-MB-231/RFP组相比,MDA-MB-231/DN-ALK2组细胞的增殖活力、集落形成率及划痕愈合率均显著降低(P<0.05),穿膜细胞数也明显减少(P<0.05);而MDA-MB-231/RFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论DN-ALK2可以在体外抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移与侵袭。     

去氢表雄酮吡唑衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

以去氢表雄酮为起始原料,经Claisen-Schmidt反应,再与芳基肼类化合物反应,获得具有吡唑结构的去氢表雄酮衍生物,产率80%～90%,其结构经~1H NMR,~(13)C NMR和ESI-MS表征,并用MTT法考察了其对人前列腺癌细胞DU-145的体外抑制活性。结果表明化合物B和C对DU-145均有一定抑制活性,其中化合物B对DU-145具有较好的抑制活性。     

人骨形态发生蛋白-7在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达

目的探讨人骨肉瘤细胞U2-OS表达重组人骨形态发生蛋白-7(recombinant human bone morphogenetic protein-7,rhBMP-7)的可行性。方法将hBMP-7成熟肽基因片段克隆至载体pcDNA3.1上,构建真核表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7。利用Lipofectamine 2000将重组质粒转染至U2-OS细胞中,采用实时荧光定量PCR及Western blot法检测细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达。结果真核组表达质粒pcDNA3.1-rhBMP-7经NdeⅠ和EcoRⅤ双酶切及测序鉴定证明构建正确。pcDNA3.1-rhBMP-7质粒转染的U2-OS细胞中hBMP-7基因mRNA和rhBMP-7的表达水平均明显高于pcDNA3.1载体转染的细胞(P0.05)。结论成功构建了hBMP-7基因的重组表达质粒,并在U2-OS细胞中成功表达,为进一步研究hBMP-7的制备方法和建立新的表达系统奠定了基础。     

RI基因siRNA干扰质粒的构建及其对人膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

目的构建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干扰质粒,并检测其对人膀胱癌细胞BIU-87迁移和侵袭能力的影响。方法设计并构建针对RI基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体和1个无同源性的阴性对照载体,经酶切和DNA测序鉴定后,转染BIU-87细胞,通过RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测干扰的有效性。光镜及HE染色观察细胞形态的改变,黏附试验、划痕试验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构。结果酶切和测序结果证明干扰质粒构建正确;转染特异性siRNA表达载体的BIU-87细胞RI蛋白的表达水平明显降低,对照组未发生明显改变;转染干扰质粒的细胞堆叠严重,细胞黏附能力显著降低,迁移和侵袭能力显著提高,细胞骨架微丝聚集,伸展出片状伪足。结论已成功构建RI基因siRNA干扰质粒,其可显著提高膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,说明RI可作为抑制肿瘤迁移和侵袭的有效靶点。     

T-cadherin基因在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞DU145增殖的影响

目的探讨T-cadherin基因在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞DU145增殖的影响。方法采用RT-PCR法检测40份前列腺癌及相应癌旁组织中T-cadherin基因mRNA的表达。分别用10 ml滴度为1.6×10~(12)pdf/ml的GFP-T-cadherin腺病毒(Ad-GFP-T-cadherin)和GFP腺病毒(Ad-GFP)感染前列腺癌DU145细胞后,MTT法检测T-cadherin对前列腺癌DU145细胞增殖的影响,Western blot法检测T-cadherin对P21和cyclin D1蛋白表达水平的影响,同时设空白对照组(未感染病毒)。结果 T-cadherin在38/40(95%)的前列腺癌中表达下调(P0.01),其表达与前列腺癌的分期、格里森评分及分化有关。Ad-GFP-T-cadherin组DU145细胞中P21蛋白表达水平明显高于Ad-GFP组及空白对照组(P0.01),而cyclin D1蛋白表达水平及增殖活性明显低于Ad-GFP组及空白对照组(P0.01);空白对照组DU145细胞的增殖活性及细胞中P21、cyclin D1蛋白表达水平与Ad-GFP组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论 T-cadherin的表达与前列腺癌的发生密切相关,且可通过上调P21和下调cyclin D1蛋白的表达抑制前列腺癌DU145细胞的增殖。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的构建脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)基因的真核表达载体,并检测其对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。方法采用逆转录方法从星型细胞瘤组织中扩增FABP7基因,双酶切后插入线性化的pcDNA3.1载体真核启动子下游,构建重组真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7后,采用半定量RT-PCR检测FABP7基因mRNA的表达,MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的周期变化情况,并对细胞进行计数。结果FABP7基因重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,转染MCF-7细胞后48、72和96h,pcDNA3.1-FABP7组的细胞数和细胞的A490值均比pcDNA3.1空质粒组明显降低,G1期细胞百分含量均明显升高。结论已成功构建了FABP7基因的真核表达载体,该载体可抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。     

bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

目的建立bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株。方法从CHO细胞中提取总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法扩增bcl-2基因,克隆入pcDNA3.1载体中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-bcl-2。利用脂质体转染法转染CHO-dhfr-细胞,用硫酸新霉素筛选阳性克隆,命名为CHO-G6细胞。通过流式细胞术检测bcl-2基因的表达及细胞凋亡水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果CHO-G6细胞bcl-2基因表达阳性率(92.46%)明显高于CHO-dhfr-细胞(76.08%);CHO-G6细胞的凋亡率(1%)明显低于CHO-dhfr-细胞(19%);在无血清培养基中培养1～5d,CHO-G6细胞的增殖活力均明显高于CHO-dhfr-细胞。结论已成功构建了表达bcl-2基因并具有一定抗凋亡能力的重组CHO细胞株,为进一步应用该细胞株生产重组蛋白奠定了基础。     

外源性p53基因增强卵巢癌细胞对化疗和放疗的敏感性

目的 探讨外源性p53基因转染对人卵巢癌细胞系的化疗、放疗敏感性的影响。方法 用分子克隆技术构建人野生型 p53基因与真核细胞表达载体 pcDNA3的重组体（pcDNA-p53）,并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的卵巢癌SKOV-3细胞中,经 G418筛选,Northern blot及Western blot鉴定后,观察p53基因转染对顺铂或X线放射作用的SKOV-3细胞的集落形成的影响。结果 成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体。外源性 p53基因在转染细胞中有效表达,增强了顺铂或X线放射对 SKOV-3细胞集落形成的抑制作用。结论 外源性p53基因能增强卵巢癌细胞对顺铂或放射的敏感性,p53基因治疗与化疗或放疗联合作用能更大程度地杀灭肿瘤细胞。     

肺癌抑癌基因1对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响

目的探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用

目的构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期。结果所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低。结论成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用。     

hCAP-18/LL-37基因转染对RAW264.7细胞活化功能的影响

目的探讨抗菌肽hCAP-18/LL-37基因转染对巨噬细胞RAW264.7活化功能的影响。方法将重组质粒pcD-NA4/Myc-His-hCAP-18/LL-37瞬时转染RAW264.7细胞,MTT法检测细胞的增殖活性;中性红吞噬试验检测细胞的吞噬能力;RT-PCR法分析细胞活化相关分子CD80、CD86、TLR4及细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA的转录。结果 hCAP-18/LL-37基因转染可促进经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理的RAW264.7细胞的增殖活性与吞噬能力(P<0.05);可上调RAW264.7细胞CD80、CD86、TLR4、IL-1β、TNF-α基因mRNA的转录水平。结论 hCAP-18/LL-37基因转染可通过促进RAW264.7细胞增殖活性、吞噬能力及活化相关分子表达,调控巨噬细胞的活化功能。