疏棉状嗜热丝孢菌耐热脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达

综合考虑密码子偏爱性、RNA稳定性以及自由能等因素,对疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)耐热脂肪酶(tll)基因序列进行密码子优化并全基因合成。将合成的tll基因连接到克隆载体,然后亚克隆到表达载体pHGWPT-tll,采用根癌农杆菌介导转化无孢黑曲霉SH-2。经过三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE以及Western Blotting鉴定,成功表达了tll基因。发酵72h,转化子脂肪酶酶活最高达36U/mL。转化子经等离子诱变得到的突变株的脂肪酶比活力比出发菌株提高约37%。     

高产高纯度脯氨酰内肽酶黑曲霉工程菌的构建

利用基因工程技术,构建过表达黑曲霉来源带有自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-protAS和过表达以黑曲霉内源高效分泌的葡糖淀粉酶信号肽以及α-淀粉酶信号肽代替自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA。SDS-PAGE结果显示,脯氨酰内肽酶在重组菌株中分泌表达,但是存在不同程度的糖基化。酶活检测结果表明,重组菌株TH2-protAS、TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA的最高酶活分别为1.70、2.19、1.91 U/mL。在重组菌株TH2-SglaA-protA的基础上,利用基因敲除技术,敲除了主要的背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶,结合发酵条件优化,获得了高纯度的脯氨酰内肽酶。综合上述结果可得出结论:可在黑曲霉中同源高效分泌表达脯氨酰内肽酶;glaA信号肽和amyA信号肽明显增加黑曲霉中脯氨酰内肽酶的分泌表达量,且glaA信号肽的效果优于amyA信号肽;将基因敲除和发酵调控相结合,可以有效去除分泌的背景蛋白,获得高产高纯度脯氨酰内肽酶的菌株,该重组菌株具有明确的工业应用潜力。     

黑曲霉高产糖化酶的分子水平研究方法概论

黑曲霉是一株产糖化酶的特殊菌株,而糖化酶在制造葡萄糖、氨基酸、抗生素等发酵工业上有着广泛的应用。以黑曲霉出发菌株为研究材料,基因改造作为研究背景,通过综述诱变育种、基因敲除、RNA干扰、基因重组表达等分子改造技术,将改造后的菌株与出发菌株生产糖化酶的产量及活性分别进行测定评估。以此探讨高产糖化酶的黑曲霉分子改造的优良手段,为以后设计新的效率更好的高产糖化酶的黑曲霉分子改造研究提供技术支持。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2,构建出含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pBBR1MCS-2GA,用三亲和接合转化法将重组质粒导入2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4。得到重组菌ARW4,经SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析显示,黑曲霉糖化酶基因在ARW4中得到表达,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。     

利用RNAi抑制cre1基因转录提高里氏木霉表达纤维素酶

本研究采用RNA干扰技术(RNAi)对里氏木霉主要的转录抑制因子cre1基因的表达进行抑制,以期提高里氏木霉生产纤维素酶的能力。通过PCR,从里氏木霉的基因组中扩增得到cbh1启动子、反向的cre1基因片段(568~963 bp)、正向的cre1基因片段(655~961 bp)和cbh2终止子,利用DNA assembler方法将这些基因连接到pRS424质粒上,构建成p Cre1-i质粒。再将RNAi盒分作两个片段扩增,同时转化里氏木霉并通过PCR鉴定阳性转化子。摇瓶发酵显示其中一株转化子在纤维素诱导培养基中培养4.5 d后,其纤维素酶的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和CBHI酶活为0.67、3.70和0.46 U/m L,较出发菌株分别提高了1.3、1.8和5.6倍。通过实时荧光RT-PCR检测,发现该转化子中cre1基因的转录水平比出发菌株降低了43%。     

白曲酸性蛋白酶在无孢黑曲SH-2中的克隆表达及酶学性质分析

白曲霉酸性蛋白酶在白酒酿造发酵过程中具有溶解发酵原料的颗粒,促进微生物繁殖,分解蛋白质生成香味物质,降解酵母菌体蛋白等多种功能,可以提高白酒风味,因此被广泛应用于白酒生产中。本研究利用经基因工程改造的低内源蛋白背景的黑曲霉宿主SH-2,表达白曲霉酸性蛋白酶基因pepB。通过PCR技术获得pepB以及表达元件糖化酶启动子PglaA、糖化酶终止子TglaA、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶标记基因pyrG,在pMD18-T载体基础上,构建了pepB表达载体,通过PEG介导转化法转化无孢黑曲酶SH-2。重组菌株经发酵罐发酵240 h,发酵粗酶液酶活达9722 U/mL,是报道的白曲原始菌株酶活的8.5倍,SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为47 ku。酶学性质分析结果表明,该酸性蛋白酶最适反应温度为35℃,最适pH为4.0,Mn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有显著地激活作用。最后,探究了在不同发酵初始pH下重组菌株酶活的变化,结果显示,在pH 4.5~6.5范围内,适当提高发酵初始pH,酸性蛋白酶酶活会提高。以上结果表明,本研究成功构建了一株能胞内高效表达白曲酸性蛋白酶的菌株。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

根据毕赤酵母密码子的偏好性,通过在线软件对Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb）进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）中碱基GC含量分别由原来的46%提高到49%和42%提高到51%,碱基A、T、C、G均匀分布,减少了AT和GC富集区,利于tll-opt和vhb-opt基因在毕赤酵母X33中的表达。将tll和tll-opt连接到表达载体pPICZαA并转入毕赤酵母X33中。摇瓶培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为7 U/mL和16 U/mL。50 L发酵罐培养条件下,含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为201 U/mL和430 U/mL。为了进一步提高含tll-opt重组工程菌的表达酶活性,将vhb-opt转入该重组工程菌得到工程菌VHb＋（含有tll-opt和vhb-opt）。重组工程菌VHb＋在摇瓶培养条件下最大酶活力为23 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.39 倍和3.28 倍。重组工程菌VHb＋在50 L发酵罐瓶培养条件下最大酶活力为610 U/mL,分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。     

18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。     

烟草抗病毒相关R基因RNAi 表达载体的构建

RNA 干扰介导的基因沉默是植物抗病育种和大规模分析功能基因快速而有效的方法。构建烟草抗病毒病相关 R 基因的RNAi表达载体并导入烟草可获得抗病毒病烟草材料,并为大规模分析鉴定烟草功能基因提供新方法。本研究利用绒毛状烟草基因组测序获得的 R 基因序列设计引物,通过 PCR 技术扩增出带有特异性结合位点 attB 的 R 基因部分序列。采用GATEWAY 方法将目的基因的干扰片段插入到表达载体 pH 7 GWIWG2(I),成功构建了烟草抗病毒病相关 R 基因的 RNAi表达载体。     

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

Cloning and sequencing of the chromosomal DNA and cDNA encoding the mitochondrial citrate synthase of Aspergillus niger WU-2223L

The complementary DNA (cDNA) and chromosomal DNA encoding the citrate synthase (EC 4.1.3.7) gene (cit1) of Aspergillus niger WU-2223L, a citric acid-producing strain, were cloned. Synthetic oligonucleotide primers were designed according to the amino acid sequences of already known eukaryotic citrate synthases and the codon bias of A. niger genes. The 920-bp DNA fragment was amplified by polymerase chain reaction with these primers using chromosomal DNA of WU-2223L as a template, and was employed to screen a cDNA library of A. niger. One full-length cDNA clone was isolated and sequenced, within which an ORF of 1425 by encoding a protein of 475 as with a molecular weight of 52,153 Da was found. Its N-terminal region contains a typical mitochondrial-targeting motif. The predicted as sequence was 82, 68, and 65% homologous with the mitochondrial citrate synthases of Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, and pig, respectively, but it showed lower homology to bacterial citrate synthases. The full-length cDNA clone was used to screen a chromosomal library of A. niger WU-2223L, and a 7.5 kb-SalI fragment containing the corresponding chromosomal gene was isolated. Comparison of the chromosomal and cDNA sequences revealed that the cit1 gene is interrupted by six introns. In the chromosomal DNA, upstream of the coding region, a CT-rich region, but not the TATAAA or CAAT motifs, was found. Escherichia coli MOB150, a citrate synthase-deficient mutant showing a glutamate-requiring phenotype, was transformed with the plasmid pKAC-35S, which is the expression vector pKK223-3 containing the cDNA fragment encoding a putative mature protein of A. niger citrate synthase. The transformant harboring pKAC-35S showed citrate synthase activity and a glutamate-nonrequiring phenotype.     

青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因的克隆、分析与表达

为研究和调控青钱柳三萜代谢,克隆了青钱柳鲨烯合成酶(CpSS)全长基因,研究该基因的特征和蛋白结构,以及青钱柳悬浮培养细胞在黑曲霉诱导子作用下该基因的表达变化情况。本文以青钱柳悬浮细胞RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出全长为1 667 bp的CpSS基因cDNA序列,该序列包含一个1 245 bp的完整ORF,编码414个氨基酸;CpSS序列与胡桃鲨烯合成酶基因的相似度最高,相似度达到97%,与白桦、葡萄、大豆、甘草、可可5个物种的相似度都在85%以上。序列分析表明,CpSS蛋白属于不稳定亲水蛋白,具有典型的鲨烯合成酶保守区和结构域,存在于内质网膜中,由多个α螺旋组成空穴状结构,该结构与大多数植物鲨烯合成酶蛋白的空间结构相似。实时荧光半定量RT-PCR检测结果表明,在黑曲霉诱导子作用下,悬浮培养细胞CpSS基因表达量显著增加,在诱导后60 h时的表达量最高。本文可为深入研究青钱柳三萜代谢途径及真菌诱导子的诱导作用机制提供参考。     

采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建

为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈,本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR,从糖化酶基因(glaA)高效表达的泡盛曲霉菌株SG1 基因组DNA 扩增获得glaA 2.1 kb 启动子片段(包含信号肽编码序列)及1.1kb 终止子片段,构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302 为基础,删除非必需区段及多余限制酶位点,插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1 的潮霉素抗性标记,构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21 个转化子/106 分生孢子,而农杆菌介导法可达1106 个转化子/106 分生孢子,是原生质体法的53 倍。构建载体成功利用glaA 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性,可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。