伤寒Vi荚膜多糖菌苗的研究

Robbins等人证实:用不变性方法提纯的伤寒沙门氏菌荚膜多糖(Vi抗原)不仅有抗原性,且对伤寒沙门氏毒菌攻击具有保护作用。我们用不变性方法提纯了Vi抗原并对其化学和生物学特性进行了检定,初步证实了Robbins Vi抗原具有保护作用的意见,用0.5～1.0μg提纯的Vi抗原免疫,对Vi~+的伤寒沙门氏毒菌菌株的攻击可提供高度防御作用。     

伤寒沙门氏菌外膜蛋白的研究

本文以简化的方法从伤寒沙门氏菌Ty2菌苗株制备外膜蛋白(Outer membraneprotein,简写为OMP),OMP的生化检测显示主要为蛋白质,并有少量LPS污染,不含有Vi多糖。由SDS-PAGE显示OMP为一组分子量介于17～70KD的蛋白质,其中分子量为36～41KD左右的蛋白带为主要蛋白带。OMP有良好的免疫原性和抗原性,不加佐剂免疫动物可产生高效价抗血清,玻片凝集试验能与不同类型抗原结构的伤寒沙门氏菌凝集,但这种凝集可因细菌Vi抗原的存在而被阻抑。动物试验表明OMP有良好的免疫原性,自动和被动免疫力试验均能对小鼠有良好的保护作用,表明OMP是一种保护性抗原。动物热原试验和体重减轻试验及毒性试验均符合有关要求。     

伤寒沙门氏菌特异性θ诊断血清的应用

应用新的特异性θ诊断血清和传统商品血清与434株伤寒沙门氏菌地方株作玻片凝集平行试验，两者诊断符合率为100％。θ血清与0．1％酚琼脂斜面上的所有伤寒沙门氏菌呈迅速清晰的阳性凝集反应。鉴于θ血清与大多数D群沙门氏菌不凝集，因此，大大提高诊断的正确性。     

伤寒-鼠伤寒基因重组菌株Vi4072与伤寒Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原比较

将来源于枸橼酸杆菌编码产生Vi抗原的ViaB基因片段,通过基因重组技术引入减毒的鼠伤寒杆菌而组建的Vi4072重组株与伤寒沙门氏菌Ty2株和枸橼酸杆菌的Vi抗原,通过琼脂双向扩散试验、被动血凝试验、对BALB/c小鼠的免疫力试验以及对Vi抗原分子的化学元素含量、红外光谱、超导核磁C谱、H谱分析测试。结果表明上述三种菌株产生的Vi抗原其血清学特性、免疫保护作用及化学分子结构等基本相同。且Vi4072重组株表达Vi抗原量高于伤寒Ty2株。     

细菌诊断血清吸收菌杀菌剂的改进

长期以来，我国制造细菌诊断血清的吸收菌采用较高浓度的甲醛溶液杀菌。由于甲醛能使蛋白质变性，降低血清效价及稳定性，故吸收菌在使用前须经3次离心洗脱甲醛，不仅耗费人力物力，生产周期长，而且吸收菌易自凝。我们根据文献资料和自己的经验，设计试验了适用于沙门氏菌、志贺氏菌、病原性大肠艾希氏菌诊断血清吸收菌的杀菌剂，即0．1％碘化汞与0．1％福尔马林的混合液，并与传统的福尔马林杀菌法作了比较。本试验共用21株菌种，包括沙门氏菌10株，志贺氏菌7株及病原性大肠艾希氏菌4株。试验了3种碘化汞杀菌剂浓度，即0．1％碘化汞与0．3…     

包被伤寒Vi多糖抗原检测鼠血清中伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法的建立

目的建立检测伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗体的间接ELISA方法,并进行验证。方法对常规间接ELISA方法进行优化,确定抗原最适包被质量浓度及被检血清最佳稀释度、最适包被温度及时间、包被抗原与血清的最适温度和时间、血清与酶标二抗及封闭的最适温度和时间、酶标二抗最适工作质量浓度,并验证该方法的灵敏度、精密性、特异性及耐用性;用伤寒Vi多糖结合物原液和伤寒Vi多糖衍生物经小鼠大腿内侧皮下免疫,分别于免疫后第14、21、28、35天,经眼眶采全血,分离血清,应用建立的间接ELISA方法检测抗体水平,计算抗体几何平均滴度(GMT)。结果确定了间接ELISA方法最适工作条件:伤寒Vi荚膜多糖抗原最适包被质量浓度为5μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶40;最适包被温度及时间为4℃12 h;包被抗原与血清最适反应温度和时间为37℃2 h;血清与酶标二抗最适反应温度和时间为37℃1 h;封闭液最适封闭温度和时间为室温1 h;HRP标记的羊抗鼠IgG最佳反应浓度为1∶8 000。该方法灵敏度为1∶1 600;孔间和板间CV平均值分别为2.8%和5.8%;与其他血清无交叉反应;pH值、包被时间、包被温度及酶结合时间调整前后,同一样品检测的A450值差异无统计学意义(P0.05)。伤寒Vi多糖与蛋白载体偶联后,免疫原性明显增强,且白喉类毒素(diphtheria toxin DT)和重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinantPseudomonasaeruginosaexotoxinA,rEPA)两种不同载体偶联得到的结合物免疫原性无明显差异。结论成功建立了一种检测伤寒沙门菌抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、灵敏度及精密性。     

人血清中抗伤寒Vi多糖特异IgG抗体含量ELISA检测方法的建立及验证

目的建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量的ELISA方法,并进行验证。方法以美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)测定Vi抗体的ELISA方法为主要参考,对包被抗原、不同吸附力酶标板、抗原包被浓度、样品反应条件、显色时间进行优化,建立测定人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量的ELISA方法,并对建立的方法进行特异性、线性、准确性、精密度、最低检测限验证。结果优化的ELISA法为:以伤寒Vi多糖作为包被抗原,costar92592型酶标板作为检测酶标板,2.0μg/ml为抗原包被浓度,20~25℃过夜为样品的反应条件,在40~80 min内(A405值在1.8~2.5之间)终止显色。质控血清经不同含量多糖吸收后,抗体含量与多糖浓度具有明显的浓度依赖关系,多糖抑制率最高可达92%;血清稀释度与抗体含量存在负相关的线性关系,R2=0.999;本试验检测的质控血清抗体浓度为76.80 EU/ml,变异系数(CV)=8.55%,与美国NIH检测的数据(75 EU/ml,CV≤15%)一致性良好;该方法重复性(CV≤15%)及中间精密度(CV≤20%)均符合要求;最低检测限为0.78 EU/ml。结论建立了人血清中抗伤寒Vi多糖特异Ig G抗体含量ELISA检测方法,该方法特异性、线性、准确性、精密度良好,可快速、准确地检测人血清中抗伤寒Vi多糖Ig G抗体含量。     

伤寒、副伤寒甲沙门菌毒性和抗原性的稳定性

目的观察伤寒Vi多糖结合疫苗生产用菌株伤寒沙门菌CMCC50098株和副伤寒甲沙门菌CMCC50073株毒性和抗原性的稳定性。方法将CMCC50098和CMCC50073菌株分别连续传代至30代,取3、5、10、15、20、25、30代次菌,进行小鼠毒性试验,免疫家兔制备血清,进行抗原性试验。结果CMCC50098和CMCC50073菌株连续传30代,毒性均未改变,抗原性均未下降,血清凝集效价均达到1∶12800。结论CMCC50098和CMCC50073菌株连续传代至30代,毒性及抗原性均稳定。     

伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化

目的优化伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法。方法采用DEAE离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为6.0、7.0和8.0的条件下纯化1批伤寒Vi多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较。按《中国药典》三部(2010版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率。采用优化的DEAE柱层析纯化工艺纯化3批伤寒Vi多糖粗糖,验证该工艺的稳定性。结果 DEAE离子交换柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为7.0和8.0时,可有效将伤寒Vi多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36.52%和38.35%,明显高于传统工艺的多糖回收率(15.52%),且纯化产物的内毒素含量(10 EU/μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg)。以优化工艺(pH 7.0)纯化3批伤寒Vi多糖粗糖获得的6批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5%。结论优化了伤寒Vi多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi多糖的纯化。     

伤寒Vi多糖菌苗的安全性和免疫效果研究

对我国首次研究成功的伤寒Vi多糖菌酋进行了人体接种安全性、反应性、血清学效果和流行病学效果观察,各期观察达21万余人,结果证实伤寒Vi多糖茵茵安全世良好,反应轻微。血清学效果显示,30μg一次免疫,Vi抗体4倍增长可达91．6％。两次流行病学效果考核,按血培养伤寒杆菌阳性病例统计,保护率可达70％左右,茵茵的效果指数为3．29～3．49。该菌苗性质稳定,初免只需注射一针,替代现行菌体菌苗推广应用是完全可行的。     

镧、钇掺杂铕-樟脑酸-1,10-菲咯啉三元配合物的合成及荧光性能

实验合成了单核铕-樟脑酸-1,10-菲咯啉三元配合物和La、Y掺杂异核铕-樟脑酸-1,10-菲咯啉三元配合物。通过配位滴定、元素分析和红外光谱等测试,确定其组成为RE2(CA)3(phen)2(RE为Eu、La和Y;CA为樟脑酸;phen为1,10-菲咯啉);通过三维荧光光谱图确定其最佳激发波长为330.0 nm,即在330.0 nm激发光下的发射光谱图中均显示出Eu3+离子5D0→7F0(579nm),5D0→7F1(594 nm)和5D0→7F2(612 nm)等三条特征谱线,其中5D0→7F2(612 nm)为最强跃迁峰。荧光强度变化研究表明,适量镧和钇离子的掺杂并没有降低铕离子的荧光强度,说明镧和钇对铕离子荧光发射有敏化作用。     

低浓度牛血清培养Vero细胞的研究

用人血浆组分IV中某些成分配制的低浓度牛血清（2％）培养液（称Ⅱ号培养液），培养Vero细胞的效果与美国GIBCO公司的低浓度牛血清培养基添加物Gms－A类似；用所培养的Vero细胞感染狂犬病毒，其病毒滴度均大于6．0logLD50／ml）；而残余牛血清含量从50～100μg／ml降至5～10μg／ml。     

载脂蛋白B_(100)杂交瘤细胞株的建立及单抗免疫学特性的研究

采用密度梯度离心法从新鲜人血浆中快速分离提取高纯度的LDL,以此免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交技术建立了11株稳定分泌抗ApoB_(100)的杂交瘤细胞株,所分泌的11种单抗除L_2/169为IgG2b外,其余均为IgG_1。腹水抗体效价为10~(-5)～10~(-8)。应用ELISA间接法证明,11种单抗均与ApoB_(100)(本研究制备及Sigma产品)产生强阳性反应,部分单抗与VLDL产生反应,而均不与其它包括脂蛋白、载脂蛋白在内的血浆蛋白产生反应。应用免疫印迹法证明,各种McAb识别的靶抗原分子量为525KD。对其中4种McAb的抗原表位特异性也进行了研究,通过相加试验及双抗体竞争试验均证实,4种单抗可分为2组,各识别不同的抗原决定簇。     

牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

目的建立牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用大肠杆菌表达的牛布氏杆菌重组BP26蛋白作为检测抗原,用棋盘滴定法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA方法,并进行验证。采用建立的间接ELISA方法与传统的试管凝集试验同时检测116份血清样品,评价二者的符合率。结果间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被量5μg/孔;待检血清稀释倍数1∶200,作用时间60min;酶标二抗作用时间60min;封闭液为5%BSA,作用时间45min。S/P值≥0.363者判为阳性,S/P值≤0.291者判为阴性,介于两者之间判为可疑。该方法精密性良好,特异性较强,敏感性较高,与传统的试管凝集试验检测结果的符合率为93.3%。结论已成功建立了检测牛布氏杆菌特异性抗体的间接ELISA方法,为布氏杆菌病的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

分光光度法测定工业己内酰胺中铁

在ｐ Ｈ＝ ７ 的 Ｎ Ｈ４ Ａｃ 缓冲介质中， Ｃ Ｔ Ｍ Ａ Ｂ 微乳液存在下， Ｆｅ（ Ⅲ） 和铬天青 Ｓ 生成蓝色络合物，λｍａｘ＝ ６５５ｎｍ ，ε＝ １ ．４０ ×１０５ Ｌ·ｍｏ Ｌ－ １·ｃｍ － １ ，铁含量在０ ～６μｇ／２５ｍ Ｌ 内符合比尔定律，方法用于工业己内酰胺中铁的测定，结果满意。