几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶（CsLPMO）为研究对象，在克隆CsLPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析，利用3种表达质粒pET-22b、pET-28a和pCold，构建CsLPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组CsLPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，筛选最佳表达质粒，对其表达条件进行优化。结果表明，CsLPMO是一种裂解性多糖单加氧酶，隶属于AA10家族。3株重组菌中，纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%，比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg，因此，确定最佳质粒为pET-22b，菌株EBL-22表达条件为：OD600 nm值至0.4时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L后，在25 ℃下诱导表达16 h。在优化条件下，其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L，比酶活力为3.34 U/mL。CsLPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSE-prha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60?℃,Km值为（3.039±0.581）mmol/L,Vmax值为（2.032±0.186）μmol/（min·mg）;PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45?℃,Km值为（2.797±0.132）mmol/L,Vmax?值为（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA）有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。     

硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABC Ⅱ（chondroitinase ABC Ⅱ,ChSase ABC Ⅱ）的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABC Ⅱ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABC Ⅱ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABC Ⅱ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签（polyhistidine-tag,His-tag）的ChSase ABC Ⅱ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABC Ⅱ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABC Ⅱ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）浓度为125 μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABC Ⅱ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40 ℃,其在30~40 ℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABC Ⅱ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_m值为10.4±0.8 μmol/L,K_cat值为9.4±0.2 s?1。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABC Ⅱ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABC Ⅱ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。     

产红色素赤红球菌的筛选鉴定和产色素条件的优化

将一株土壤中分离筛选出的产红色素菌株采用生理生化及分子生物学鉴定,根据菌株的16Sr DNA序列分析结果及生理生化特性,该菌株归属为赤红球菌(Rhodococcus ruber)。以此菌株为出发菌株,通过单因素筛选及正交试验对赤红球菌发酵色素培养基以及培养条件进行优化研究。确定最优培养基配方为:果糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉15 g/L、氯化钠10 g/L、玉米浆15 g/L;最佳培养条件为:培养温度28℃、摇瓶装液量50 mL/250 mL、转速190 r/min、接种量4%、p H6.5,发酵液产菌体干重达到6.6 g/L,红色素粗品产量达到0.93 g/L。     

耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸合酶基因的差异

目的:研究筛选得到的野生耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因(cfa)的差异,探索酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因与酒酒球菌耐酸性的相关性。方法:35株野生酒酒球菌中,利用酸胁迫环境筛选耐酸能力最强的菌株,并与野生酸敏菌SX-1b及实验室离子注入诱变的耐酸、酸敏突变菌a3、b2共同进行环丙烷脂肪酸基因cfa的克隆、测序和比对;选择存在氨基酸突变的野生耐酸酒酒球菌及野生酸敏菌株的cfa基因在植物乳杆菌ATCC33222中进行外源表达,从而验证耐酸菌株cfa基因与耐酸能力的相关性。结果:(1)筛选出野生型耐酸酒酒球菌CS-7b和ME-5b,确定其耐酸生长极限为p H 2.6;(2)对野生菌与诱变菌的cfa基因进行测序比对发现,耐酸菌株的野生型和诱变型的序列相同,较酒酒球菌PSU-1发生3处碱基突变,而酸敏菌野生型、诱变型的序列则与酒酒球菌PSU-1一致;(3)将SX-1b与CS-7b的cfa基因在植物乳杆菌中表达,构建重组载体pMG36ecfa1和pMG36e-cfa2,并得到对应重组菌L1和L2;(4)在pH 3.6培养基中培养,重组菌L1和L2的生长情况明显优于含空载体的植物乳杆菌L0,且L2的生长优于L1。而在p H 3.4培养基中培养,L0没有生长迹象,只有重组菌L1和L2正常生长,cfa基因的导入突破了植物乳杆菌宿主菌的生长极限。结论:酒酒球菌cfa基因及基因间存在的稳定差异与菌株耐酸表型具有一定相关性。     

大肠杆菌分泌表达烟酰胺单核苷酸合成途径酶及催化体系优化

烟酰胺单核苷酸（NMN）是具有重要医用价值的NAD+前体,通过信号肽PelB实现大肠杆菌BL21(DE3)分泌表达催化NMN合成的烟酰胺磷酸核糖转移酶（Sfnampt）、磷酸核糖焦磷酸激酶（Tkprs）和核糖激酶（Erbks）。对三酶的酶学特性分析显示,Sfnampt、Tkprs和Erbks的最适反应温度分别为45、50和37 ℃,最适pH值分别为7.5、8.5和5.5。热稳定性分析发现,Sfnampt在35 ℃热稳定性良好而在40~55 ℃较差;Tkprs在40~60 ℃热稳定性良好;Erbks在25~40 ℃热稳定性良好而在45 ℃较差。酶动力学分析可知,Sfnampt、Tkprs和Erbks的Vmax分别为0.65 μmol/(L•min)、2.37 μmol/(L•min)、12.58 μmol/(L•min),Km分别为2.87 μmol/L、25.48 μmol/L和74.13 μmol/L,Tkprs、Erbks与已表征的Prs、Rbks相比底物亲和力好。将分泌表达的三酶用于催化合成NMN,温度37 ℃、pH值8.0为较优催化条件。底物ATP以及酶Sfnampt在反应体系中为关键因素,经底物和酶配比优化后,使用三酶经过7 h催化可获得5.50 μmol/L的NMN。该研究在大肠杆菌系统成功实现了NMN合成途径酶的分泌表达,为NMN合成提供了新思路。     

木犀草素与叶酸对黄曲霉毒素B1致食管上皮细胞毒性及MTHFR基因高甲基化的影响

目的：研究木犀草素（luteolin,LUT）与叶酸（folic acid,FA）对黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）诱导损伤的人正常食管上皮细胞（human normal esophageal epithelial cells,HEEC）MTHFR基因甲基化的影响。方法：不同浓度（0、13、25、50、100、200 μmol/L）AFB1染毒HEEC 24、48、72 h,CCK-8法检测细胞活力;将HEEC分为空白对照组、AFB1染毒组（200 μmol/L）、LUT干预组（160 μmol/L）、FA干预组（20、200 μmol/L）以及联合干预组（160 μmol/L LUT＋20 μmol/L FA、160 μmol/L LUT＋200 μmol/L FA）,处理24 h后CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Western blot检测MTHFR蛋白的表达水平,MassARRAY甲基化检测MTHFR基因启动子区甲基化的情况。结果：不同浓度的AFB1染毒HEEC 24、48、72 h均可以抑制细胞增殖,而经LUT和FA干预后,与AFB1染毒组相比,LUT及联合干预组细胞周期阻滞显著减少（P＜0.05）,细胞抑制率及凋亡率显著降低（P＜0.05）,MTHFR蛋白表达上调有所改善（P＜0.05）。且LUT与FA及二者联合对MTHFR基因启动子区高甲基化水平均有降低作用（P＜0.05）。结论：AFB1对HEEC有毒性作用,表现在增殖抑制、周期阻滞,促进凋亡,上调了MTHFR蛋白的表达,LUT干预可减弱这些损伤,对AFB1所致毒性起到一定的保护作用。AFB1提高了MTHFR基因启动子区甲基化水平,导致表观遗传的改变。LUT与FA及联合作用可以降低该甲基化水平,改善该表观遗传的改变。     

嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC的克隆及组氨酸融合酶蛋白的表达

应用PCR扩增嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC,重组至原核表达载体pET30b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,诱导表达的重组乙醛脱氢酶在碳端含有一个组氨酸标签。SDS-PAGE考察蛋白的表达量和亚基分子量,并对Km值进行了考察。成功构建了pET30b-aldC原核表达质粒;诱导表达了亚基分子量约为56 kDa的组氨酸融合蛋白;乙醛脱氢酶活性比对照菌增加了约3.5倍;Km值为2.874 mmol/L。成功克隆并诱导表达了含组氨酸标签的嗜碱耐盐芽孢杆菌乙醛脱氢酶基因aldC。     

大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase,MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的MnSOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒pNZ8149和经改造的质粒pNZS上,表达载体pNZ-SOD和分泌表达载体pNZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L. lactisNZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶活性对比分析。结果显示：L. lactis NZ3900/pNZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍,是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L. lactis NZ3900/pNZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。     

共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl2使得胞内血红素含量、DyP酶活力和染料脱色效率比未添加时进一步提高。以上结果为TfuDyP的功能开发奠定了基础,同时也为其他血红素依赖性过氧化物酶的研发提供借鉴。     

连翘苷对食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞的抑制作用及机制

目的：探究连翘苷对食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭的影响,分析其对这两种细胞的抑制效果及其作用机制。方法：取食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞,使用不同浓度（10、100 μmol/L）的连翘苷处理干预细胞24 h,采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK8）法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期、凋亡,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭,蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）,（也称为AKT）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）（也称为p-AKT）、p21蛋白、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）和基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9,MMP9）表达水平。结果：连翘苷对食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞的半数抑制浓度（50% inhibitory concentration,IC50）分别为308.4 μmol/L和322.0 μmol/L。10、100 μmol/L连翘苷可显著抑制食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞增殖（P＜0.05）,对人食管正常上皮细胞无毒性作用。10、100 μmol/L连翘苷可诱导食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞周期改变,促进细胞凋亡。10、100 μmol/L连翘苷可显著抑制食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞迁移及侵袭（P＜0.05）。10、100 μmol/L连翘苷可显著降低食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞中p-PI3K、p-AKT、Bcl-2和MMP9蛋白的表达水平（P＜0.05）,100 μmol/L连翘苷可显著提高食管上皮恶性转变细胞和Eca-109细胞中p21蛋白的表达水平（P＜0.05）。结论：连翘苷可显著抑制食管上皮恶性转变细胞和食管癌Eca-109细胞增殖、迁移、侵袭,其机制可能与PI3K/AKT通路失活有关。     

同源重组法构建副干酪乳杆菌组氨酸蛋白激酶基因缺失突变株

构建副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)组氨酸蛋白激酶prcK基因缺失突变株,为prcK基因功能研究提供实验工具。采用同源重组技术构建质粒p KLKRT(含prcK::Tet~r基因),将其电转化进入L.paracaseiHD1.7中,使prcK::Tet~r基因同源重组到L.paracasei HD1.7的染色体上,通过四环素耐药、氨苄青霉素敏感等特性筛选出含有prcK::Tet~r基因的新L.paracasei HD1.7。结果表明,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证及酶切验证后确定质粒p KLKRT构建成功,并成功转化入L.paracasei HD1.7中,经PCR确认L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株构建成功。该突变株产生的细菌素效价比出发菌株低23.61%。采用同源重组方法成功构建L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株,为研究L.paracasei HD1.7群体效应相关基因的分子机理奠定基础。     

金雀异黄酮通过调控Ca2＋-CaMKIV通路对Aβ25-35诱导海马神经元损伤的保护作用

目的：观察金雀异黄酮通过Ca2＋-钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（calmodulin-dependent protein kinase IV,CaMKIV）通路对Aβ25-35诱导海马神经元损伤的保护作用。方法：取24 h内新生SD乳鼠的海马组织,进行神经元的分离纯化和培养,并用免疫荧光染色进行鉴定。神经元细胞随机分为空白对照组、模型组、金雀异黄酮组（50 μmol/L）和阳性对照戊酸雌二醇组（10 μmol/L）,金雀异黄酮组和戊酸雌二醇组预处理3 h后,除空白对照组外,其他各组采用Aβ25-35诱导海马神经元构建细胞损伤模型。利用噻唑蓝法检测细胞存活率,荧光探针检测神经元细胞内Ca2＋荧光强度,Western blot检测钙调蛋白（calmodulin,CaM）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase,CaMKK）、磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（p-calmodulin-dependent protein kinase,p-CaMKIV）和p-Tau蛋白的相对表达量。结果：免疫荧光分析结果显示大鼠海马神经元分离成功。与空白对照组比较,模型组海马神经元细胞存活率极显著下降（P＜0.01）,细胞Ca2＋荧光强度极显著升高（P＜0.01）,CaM、CaMKK、p-CaMKIV和p-Tau蛋白相对表达量极显著提高（P＜0.01）;与模型组比较,金雀异黄酮极显著提高了Aβ25-35所致海马神经元损伤模型中细胞的存活率（P＜0.01）,降低了细胞Ca2＋荧光强度（P＜0.01）,下调了CaM、CaMKK、p-CaMKIV和p-Tau蛋白相对表达量（P＜0.01）。结论：金雀异黄酮对Aβ25-35诱导的海马神经元损伤具有明显的神经保护作用,其作用可能是通过Ca2＋-CaMKIV通路介导的。     

Analysis of a 30 kbp plasmid encoding histidine decarboxylase gene in Tetragenococcus halophilus isolated from fish sauce

In order to analyze the genes related to the histamine production, a strain of histamine producing halophilic bacteria, referred to as strain H, was isolated using enrichment culture and dilution-to-extinction methods with histidine broth inoculated from the fish sauce mashes. The two Japanese fish sauce mashes used, accumulate over 1000 mg/l of histamine. Phenotypic and 16 S rRNA gene sequence analyses identified strain H as Tetragenococcus halophilus, the predominant histamine producing bacteria present during fish sauce fermentation. Genetic analyses (PCR and Southern blot) of the histamine producing strain confirmed that the strain harbored a 30 kbp plasmid (pHDC) encoding a single copy of the pyruvoyl dependent histidine decarboxylase gene (hdc). A comparison of hdcA that is a structural gene of histidine decarboxylase among strain H, Lactobacillus hilgardii 0006, L. sakei LTH2076, Oenococcus oeni 9204, T. halophilus and T. muriaticus JCM10006 (T) indicated >99% sequence similarity. The hdc gene cluster consisted of 4 ORFs, hdcP, hdcA, hdcB, and hdcRS, and were almost identical to that of L. hilgardii 0006 with 99% sequence similarity including the structural hdc spacer region. However, the approximately 500 bp regions upstream and downstream of the hdc gene were different between that of strain H and L. hilgardii 0006. The complete sequence of pHDC revealed 29,924 nucleotides including 28 ORFs, two pairs of IR (inverted repeat), similar sequence of plasmid conjugative elements, and a theta-type replicon. These results suggested that hdc could be encoded on transformable elements among lactic acid bacteria.     

马乳酒样乳杆菌ZW3基因WANG_1108的特性及功能

为分析马乳酒样乳杆菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）的一株突变株2#胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）产量下降的原因。对突变株2#进行基因组重测序后与野生菌ZW3全基因组比对,分析突变基因在代谢通路中EPS产量的相关性;利用实时荧光定量-聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术分析可能会与多糖产量相关的突变基因的相对表达量;构建含有表达量变化明显基因的重组质粒转至大肠杆菌并测定其酶活性,探究突变基因与产糖量的关系。结果经全基因组分析比对,野生菌株ZW3与突变株2#在CDS区和启动子区发生突变的基因共60?个,其中相关催化反应酶类基因有6 个,分别为：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（3 个基因均为编码二羟丙酮激酶亚基部分）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亚基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸连接酶）、WANG_1108（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）,其中WANG_0292发生了同义突变。RT-qPCR分析突变基因相对表达量,发现突变株WANG_1108基因相对表达量下降明显,选取WANG_1108进一步阐明与多糖产量的关系;成功构建重组表达载体pET28a-ZW3/2#-1108、并转至表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）,诱导蛋白表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳酶活性测定结果显示,突变株中酶活性比野生菌降低了37%。由此推测基因WANG_1108的突变是影响突变株产糖量下降的原因之一。     

白藜芦醇对内质网应激介导的原代神经元细胞作用机制

目的：探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对衣霉素（tunicamycin,TM）诱导内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）模型的神经保护作用及其作用机制。方法：取怀孕18 d孕鼠分离的胎鼠海马神经元进行原代培养,设置对照组（不作处理）、TM组（质量浓度2.5 μg/mL）、Res组（5 μmol/L）和Res＋TM组（5 μmol/L Res预处理＋质量浓度2.5 μg/mL TM进一步共处理）,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK8）检测海马神经元存活率并筛选TM和Res最佳作用浓度和时间;利用流式细胞仪分别检测原代神经元凋亡水平和周期状态,通过Western blot分析细胞ERS、自噬、凋亡和周期的相关蛋白变化。结果：5 μmol/L Res预处理10 h后能减轻TM对原代神经元细胞存活率的抑制作用,使神经元细胞周期重激活,促使其由G1/G0期向S期进行。与TM组相比,Res预处理10 h组（R10T组）的葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）、Caspase 3相对表达量极显著或显著降低（P＜0.01、P＜0.05）,而自噬相关蛋白Beclin-1、微管结合蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3）B相对表达量显著升高（P＜0.05）,磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase 3β,p-GSK3β）、凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma 2,Bcl2）蛋白相对表达量高度显著或极显著升高（P＜0.001、P＜0.01）,抑制TM引起的细胞凋亡。结论：Res可以减轻TM引起的原代神经元ERS,对原代神经元起到保护作用,其作用机制与Res对细胞存活率、周期分布和自噬、凋亡相关蛋白表达调节有关。     

Riboflavin at High Doses Enhances Lung Cancer Cell Proliferation,Invasion, and Migration

The influence of riboflavin (vitamin B₂) upon growth, invasion, and migration in non‐small cell lung cancer cell lines was evaluated. Riboflavin at 1, 10, 25, 50, 100, 200, or 400 μmol/L was added into A549, H3255, or Calu‐6 cells. The effects of this compound upon level and/or expression of reactive oxygen species (ROS), inflammatory cytokines, intercellular adhesion molecule (ICAM)‐1, fibronectin, matrix metalloproteinase (MMP)‐9, MMP‐2, focal adhesion kinase (FAK), nuclear factor kappa B (NF‐κB), and mitogen‐activated protein kinase (MAPK) were examined. Results showed that riboflavin at test doses did not affect the level of ROS and glutathione. Riboflavin at 200 and 400 μmol/L significantly enhanced cell growth in test lung cancer cell lines, and at 400 μmol/L significantly increased the release of interleukin‐6, tumor necrosis factor‐alpha, and vascular endothelial growth factor. This agent at 200 and 400 μmol/L also upregulated protein production of ICAM‐1, fibronectin, MMP‐9, MMP‐2, NF‐κB p50, p‐p38 MAPK, and FAK; and at 400 μmol/L enhanced invasion and migration in test cell lines. These findings suggested that riboflavin at high doses might promote lung cancer progression.