蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

HBV S/HEV ORF2融合基因对番茄的遗传转化

应用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在戊肝病毒(HEV)ORF2部分序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BE。将融合基因BE克隆到植物双元表达载体pBin438上,获得pBin438BE,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,侵染丽春番茄子叶和下胚轴,经预培养、共培养、筛选培养、生根培养获得了5株抗卡那霉素的番茄植株。提取抗性植株基因组DNA,进行PCR及PCR-Southern检测,4株获得阳性信号。初步表明目的基因已整合到了番茄基因组中。     

选择标记基因在衣藻叶绿体中的表达

利用基因枪法将带有码壮观酶素抗性基因aadA的衣藻叶绿体表达载体p64D导入到衣藻受体细胞中,经壮观酶素抗性筛选后,获得了转化子,表明基因aadA已经在衣藻细胞中获得了表达.进一步经PCR检测和酶切Southern杂交证实,外源基因aadA已经整合到衣藻叶绿体基因组的特定位点中了.     

法夫酵母耐热基因工程菌的构建

为筛选法夫酵母耐热菌株以实现虾青素的中温化(25～40℃)生产,构建了法夫酵母整合型表达载体pUC18-kan-18S-groes,并将嗜热菌HB8的热激蛋白基因整合到法夫酵母基因组中,构建了基因工程菌法夫酵母XD-G,成功将发酵温度提高至25℃.发酵动力学研究结果表明,25℃下法夫酵母XD-G的虾青素产量达到177....     

海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

采用原核宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了具有活性的仿刺参铜锌超氧化物歧化酶(Apostichopus japonicus Cu/Zn-superoxide dismutase,Aj-SOD1)蛋白。利用Trizol法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp),构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1;在目的基因两端引入(XhoⅠ/NdeⅠ)酶切位点,构建克隆载体pMD18-AjSOD1(XhoⅠ/NdeⅠ)。将此载体与表达质粒pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。转化至大肠杆菌BL21(DE3),Kan+抗性筛选阳性转化子,获得基因工程菌BL21(DE3)-pET30a-Aj-SOD1。SDS-PAGE和邻苯三酚自氧化法检测发现,经0.1 mmol/L IPTG诱导8h后,成功获得具有抗氧化活性的Aj-SOD1蛋白。     

枯草杆菌的分子生物学研究

枯草杆菌是重要的工业生产菌。由于它的非病原性及可将产生的多种酶分泌至胞外的特点,也已成为基因工程重要的宿主菌之一.本文叙述了枯草杆菌中的多种酶基因的克隆及表达。对枯草杆菌作为基因工程的宿主菌应具备的条件、克隆载体的构建和外源基因在枯草杆菌中的表达也做了简介。     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

фC31位点特异性整合酶系统研究进展

介绍了фC31重组酶作用机制、фC31整合酶在基因治疗及其转基因动物研制中的应用、фC31整合酶催化效率的影响因素,以及фC31整合酶整合的安全性。实验证实,фC31-int可作用于多种动植物细胞及组织,将目的基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效地表达。近年来该酶在哺乳动物体内和体外的研究进展表明,фC31整合酶已经成为研究转基因、基因治疗及基因修饰的一种重要工具。     

酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2, 克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec. 该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.