抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体试剂盒的研制及应用

本文从34株脊髓灰质炎病毒单克隆抗体中,挑选23株单克隆抗体(McAb)组成两套试剂盒:一套是具有各型毒株共同特异的单克隆抗体,偶联上异硫氰酸荧光素,用直接免疫荧光试验,对脊髓灰质炎病毒进行病原学诊断;一套是具有不同毒株特异的单克隆抗体,用中和试验或间接免疫荧光试验,根据抗体在抗原上识别表位的不同及其表位分布关系,可用于脊髓灰质炎病毒毒株问的差异和抗原变异的研究,以及疫苗株与野毒株的鉴别。近年来我们收集了286株脊髓灰质炎病毒标本,用上述试剂进行了病原学的诊断及抗原性质方面的分析研究。证明了这些试剂具有高度的特异性,可快速、简便、敏感地进行病原学诊断。应用单克隆抗体试剂从抗原表位水平来分析研究毒株的性质,鉴别疫苗相关株,这是一种较为理想的选择。     

柯萨奇病毒A组16型抗原表位预测

目的应用模拟表位策略研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)抗原表位。方法分别以具有中和活性的抗CA16单克隆抗体2C6、4F9、1D8为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选可与之特异性结合的阳性克隆,对淘选得到的阳性克隆进行序列测定和比对,并采用Phage ELISA法进行特异性鉴定。同时利用生物信息学方法对CA16衣壳蛋白理化性质进行分析,并与阳性噬菌体多肽序列和结构进行比对,预测CA16中和抗原表位。结果经噬菌体12肽库筛选,单克隆抗体2C6、4F9、1D8淘选阳性噬菌体富集率分别为2.39×10~3、1.32×10~4和3.762×10,获得可与单克隆抗体2C6、4F9、1D8结合的阳性克隆分别为10、11、6种,其中各组共有基序分别为K+X+WW和N/Q+S/T+Y/F/W、K+X+WW+D/E、T+X+P+W。Phage ELISA特异性鉴定阳性克隆肽CA1和CB1、FB3和FC3、DA1和DA2、DA5分别强特异性结合单克隆抗体2C6、4F9、1D8。经计算机预测分析,确定了主要位于CA16 VP1 800-810区域,并涉及VP4、VP3上的多个中和表位区域。结论应用模拟表位策略成功筛选出了CA16中和抗原表位,为CA16蛋白抗原结构、新型表位疫苗及诊断试剂的进一步研究奠定了基础。     

从噬菌体表面展示肽库中筛选边缘无浆体膜表面蛋白5单克隆抗体识别的抗原表位

目的从噬菌体表面展示肽库中筛选边缘无浆体膜表面蛋白5(Membrane surface protein5,MSP5)单克隆抗体识别的抗原表位。方法用MSP5单克隆抗体1D8作为靶标,对噬菌体展示随机12肽库进行筛选,通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并提取阳性克隆的单链DNA,进行测序分析。结果从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与MSP5单抗1D8特异结合的噬菌体克隆,其一致序列为LING。竞争抑制试验表明,含特异序列的克隆能与MSP5重组蛋白抗原竞争。结论初步确定MSP5单克隆抗体1D8的抗原表位为线性表位,为进一步研究其在边缘无浆体诊断及新型疫苗研制中的作用奠定了基础。     

表面等离子共振技术分析抗A型肉毒毒素及抗破伤风毒素的单克隆抗体表位

目的通过表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术对抗A型肉毒毒素(botulinum toxin A,BONT/A)及抗破伤风毒素(tetanus toxin,TT)的单克隆抗体进行抗原表位分析。方法采用CM5芯片,通过氨基偶联抗BONT/A诊断血清,经Biacore T200捕获BONT/A,再进样抗BONT/A单克隆抗体A-13、A-14、C-5,通过响应值(response unit,RU)的变化来判断是否针对同一表位,并通过动物实验对抗BONT/A单克隆抗体进行生物学活性验证;采用CM5芯片,氨基偶联TT,经Biacore T200分别进样人源化抗TT单克隆抗体G2及G6,通过RU的变化来判断是否针对同一表位。结果抗BONT/A的3株单克隆抗体中,单克隆抗体A-13连续3次进样后,A-14继续进样的RU略降低,C-5进样的RU明显升高,A-13+A-14、A-13+C-5、A-14+C-5组合进样的相加指数(AI)分别为35. 8%、98. 2%、96. 0%。BONT/A剂量为2 000 LD_(50)时,A13+C5及A14+C5组小鼠在96 h内均死亡1只,A13+A14组小鼠24 h内全部死亡。G2连续3针进样后,G6进样的RU升高至825. 6;G6连续3针进样后,G2进样的RU升高至3 689. 2。结论 A-13及A-14针对同一抗原表位,与不同表位C-5之间抗体存在协同效应;抗TT的2株单克隆抗体针对不同抗原表位。     

中蜂囊状幼虫病毒LN-QY株VP3蛋白空间结构及其B细胞抗原表位的预测

目的预测中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位。方法采用RT-PCR法从感染CSBV的蜜蜂幼虫总RNA中扩增结构蛋白VP3基因,与pMD18-T载体连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒,双酶切鉴定并测序,通过与SBV-KOR、CSBV-UK株VP3基因序列的比对,获得LN-QY株VP3基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,建立VP3蛋白的3D结构。在此基础上,应用DNAStar软件中的Protean模块综合分析结构蛋白的柔性区域、亲水性、表面可能性以及抗原指数等参数。结果 VP3结构蛋白的空间构象较规则,其可能的B细胞抗原表位区域位于4个区域:25-50,101-109,112-120,250-268氨基酸区段,其中,可能出现抗原表位的2个区域在100-150和250-300氨基酸区段,应作为抗原表位研究的重点区域。结论预测了CSBV LN-QY株VP3蛋白的空间结构及其B细胞抗原表位,为CSBVVP3蛋白单克隆抗体的制备以及表位疫苗的设计奠定了理论基础。     

酿酒酵母钙通道膜蛋白单克隆抗体制备及鉴定

以酿酒酵母电压门控钙通道膜蛋白（Cch1p）、牵张敏感性钙通道膜蛋白（Mid1p）和瞬时受体电位钙通道膜蛋白（Yvc1p）为研究材料，制备其单克隆抗体。采用生物信息学方法确定3种膜蛋白抗原表位，根据分析结果克隆抗原基因，并进行原核表达和表达产物分析鉴定，通过Ni²⁺-NTA树脂亲和层析技术获得重组抗原蛋白，免疫小鼠后细胞融合技术制备单克隆抗体，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体效价，免疫印迹技术检测单克隆抗体对重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白的反应性和特异性。生物信息学分析结果表明，Cch1p、Mid1p和Yvc1p抗原表位可能分别位于1~300位氨基酸残基、359~548位氨基酸残基、1~236位氨基酸残基；克隆目的基因条带大小分别为926bp、570bp和708bp，与预期结果一致；原核表达抗原蛋白分子量分别为60000、25000和30000，Western blot检测条带正确；重组纯化抗原免疫BALB/c小鼠，细胞融合技术制备单克隆抗体，ELISA检测显示单克隆抗体效价分别高达1∶256000、1∶128000和1∶64000，Western blot检测到3种重组纯化抗原和天然酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p。这些结果说明本文制备的单克隆抗体可以成功用于检测酿酒酵母钙通道膜蛋白Cch1p、Mid1p和Yvc1p表达的相关研究。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400 HR凝胶过滤层析纯化后,与A(lOH)3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14 400²0 100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。     

乙型肝炎病毒s基因变异株抗原表位的研究

对HepG2细胞表达的HBsAg的点突变体129Ha、142Lf、145Rb、143Sg和148及野生型HBsAgb3进行了初步纯化及抗原表位的研究，发现这些突变体的颗粒密度与野生型HBsAg差异无显著意义，约为1．2；用5种HBsAga决定簇的单克隆抗体对其表位进行分析，发现129Ha、142Lf、145Rb和142Sg与这5种单抗的结合力与野生型HBsAg差异大显著意义，但148突变体的表位与野生型HBsAg明显不同，其原因还有待进一步研究。     

HCV多表位多克隆抗体的纯化及HCV-Ag的检测

目的：制备并纯化HCV复合多表位多克隆抗体,探讨其用于丙型肝炎抗原检测的潜在可行性。方法：将人工合成的HCV复合多表位抗原在大肠杆菌中表达融合蛋白后免疫小鼠分析表达产物的免疫特异性及免疫原性,免疫家兔获取多克隆抗体,利用盐析和亲和柱纯化多克隆抗体,利用该抗体用双抗夹心法检测HCV-Ag。结果：融合蛋白能在原核表达系统中高效表达,并可诱发小鼠及家兔产生高滴度的特异性HCV抗体,该HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCV-Ag中表现出较高的灵敏性（90.63%）及特异性（78.13%）。结论：通过盐析和亲和柱可高效纯化HCV复合多表位多克隆抗体,纯化后的抗体用ELISA双抗体夹心法检测HCV-Ag具有灵敏、特异、快速的优点,有望用于HCV的抗原检测。     

分解炉扩径的技术改造

我厂3号回转窑(Φ4m×60m)生产线在1996年年底由SP窑(产量912t/d)改为NSP窑(产量1320t/d),预分解系统为四级旋风预热器带离线式分解炉     

乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水的治理技术

乙烯酮(双乙烯酮)是十分重要的化工中间体,其下游产品较多。江苏某化工厂开发生产乙烯酮(双乙烯酮)下游产品三十多个,年生产规模三万多吨,是国内以乙烯酮(双乙烯酮)为中间体生产精细化学品的综合骨干企业。针对乙烯酮(双乙烯酮)下游产品废水特点,该厂结合企业实际,开展了产品优化,结构调整,清洁生产,资源循环利用,节水降耗等工作,从源头削减了污染物的生产。同时投资二千多万元新建预处理装置三套,6000m3/d废水生化处理装置一套,使全厂乙烯酮(双乙烯酮)下游产品的废水得到了有效的治理。     

水泥水化热测定方法综述

水泥水化热是中、低热水泥和核电工程用水泥的一项关键的技术指标。全球范围内测定水泥水化热的方法有溶解法、直接法/半绝热法、等温传导量热法三种。本文总结了中、美、欧相关方法标准,对其测试原理、仪器设备、试验过程等方面进行了比对,并对其在领域的应用做了简单的概括。     

基于组件技术的化工原理实验课件的设计

利用组件技术开发化工原理实验课件,给出了系统层、组件库层和应用层的架构划分。重点讨论了组件库的设计,给出了流体阻力这一典型实验的实现描述。实践证实,基于组件技术可以提高仿真实验的开发效率。     

Effect of Plastic Component of Defromation on Accuracy of Prediction of Functional Properties of Polymeric Materials

Fibre Chemistry - Classical methods for predicting polymeric materials deformation processes are based on numerical solution of governing Boltzmann-Volterra viscoelasticity type of equations, which...     

Calorimetric and Computational Study of Enthalpy of Formation of Diperoxide of Cyclohexanone

A thermochemical rather simple experimental technique is applied to determine the enthalpy of formation of Diperoxide of ciclohexanone. The study is complemented with suitable theoretical calculations at the semiempirical and ab initio levels. A particular satisfactory agreement between both ways is found for the ab initio calculation at the 6–311G basis This set level. Some possible extensions of the present procedure are pointed out.     

壳聚糖脱乙酰度测定方法研究新进展

主要介绍近年来壳聚糖脱乙酰度测定方法研究新进展,概述了双突跃电位滴定法——加酶预处理、光纤折射传感法、拉曼光谱法、库仑滴定法等测定原理与特点,并作出比较,为相关科学研究和工业生产测定方法的选择提供理论参考。     

Semi-empirical equation of state of metals. Equation of state of aluminum

A semi-empirical equation of state for metals is described. Its capabilities are demonstrated by the example of the equation of state for aluminum. New experimental data are presented on the location of the isentrope of aluminum for unloading from the state at p = 229.71 GPa on the shock adiabat to an aerogel (SiO₂) of density 0.08 g/cm³. __________ Translated from Fizika Goreniya i Vzryva, Vol. 44, No. 2, pp. 61–75, March–April, 2008.