DOPE嵌入式阳离子脂质体介导基因转运研究

二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是应用最广泛的中性磷脂,作为非病毒基因载体的重要组成部分,具有很强的细胞膜去稳定化作用,克服了阳离子脂质体高细胞毒性、制备困难、缺乏稳定性等缺点,在介导基因转运方面具有广阔的应用前景。在近年来DOPE嵌入阳离子脂质体介导基因转运研究的基础上,论述了DOPE嵌入阳离子脂质体的作用方式和在介导基因转运方面的研究现状,并展望了DOPE嵌入式阳离子脂质体的发展方向。     

多肽型阳离子脂质体的研究进展

多肽型阳离子脂质体作为一种重要的非病毒基因载体,克服了其他阳离子脂质体转染效率低、具有一定细胞毒性的缺点,在基因转运方面具有广阔的应用前景。在近年来多肽型阳离子脂质体研究的基础上,论述了多肽型阳离子脂质体在类脂的结构设计、脂质体制备及其在基因转运方面应用的研究现状,展望了多肽型阳离子脂质体的发展方向。     

不同端基肽头部阳离子类脂基因转运研究

阳离子端基肽类脂作为一种重要的非病毒基因载体,在基因转运方面具有广阔的应用前景。类脂结构是转染效率的主要因素,亲水头部起着脂质体与DNA、脂质体-DNA复合物与细胞膜或与细胞内其他组分相互结合的作用。基因表达效率与阳离子类脂的端基肽头部有关。而且,类脂的毒性也受到端基肽头部的影响。在近年来阳离子端基肽类脂的研究基础上,从阳离子端基肽类脂头部的构建进行了论述,概述了端基肽头部的种类及其基因转运效率,展望了阳离子端基肽类脂的发展方向。     

核-壳型脂质体基因载体的研究进展

脂质体作为一种重要的非病毒基因载体,在核酸和药物转运方面有着巨大的优势和潜力。近年来脂质体基因载体的研究基础上,主要介绍了脂质体-聚阳离子-DNA复合载体(LPD)和脂质体-磷酸钙纳米粒子复合载体(LCP)两种核-壳型脂质体基因载体,展望了核-壳型脂质体基因载体的发展方向及其在基因治疗领域的应用前景。     

阳离子脂质体基因转染研究

目的：评价阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化对宫颈癌细胞的转染条件。方法：以荧光素酶基因pGL3为报告基因,分析影响阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染Hela效率的因素。结果：通过细胞转染实验,得出脂质体与pDNA的稀释液混合较佳等待时间为30 min,脂质体/pDNA复合物与细胞接触的转染时间为4 h,转染效率较高。结论：Lipofectamine2000 Hela细胞转染效率较高。     

前列腺表面膜抗原适配子-阳离子脂质体-双小干扰RNA复合物治疗前列腺癌的体外分析

目的制备基于前列腺表面膜抗原(prostate surface membrane antigen,PSMA)适配子靶向前列腺癌的双小干扰RNA(small interference RNAs,siRNA)的新型阳离子脂质体,并分析该适配子-脂质体-双siRNA复合物对前列腺癌细胞的靶向性及抑制增殖作用。方法采用逆向蒸发法制备阳离子脂质体-双siRNA[Polo样激酶1(Polo-Like Kinase 1,PLK1)和B7H3(B7-homolog 3)基因]复合物,并对阳离子脂质体、鱼精蛋白与总si RNA比例进行优化。脂质体包裹双siRNA后,通过特异反应插入PSMA适配子A10。对PSMA适配子介导的双siRNA靶向入胞递送系统进行粒径和Zeta电位评价;以LNCap细胞为模型,Western blot法检测脂质体-双功能si RNA对靶基因的沉默效应;基于竞争结合的流式法检测递送系统对靶细胞的亲和性;增殖活性试验检测递送系统体外对前列腺癌细胞的抑制作用。结果阳离子脂质体与总siRNA的最佳比例为300∶1,鱼精蛋白与总siRNA的最佳比例为1.7∶1。A10-脂质体-双siRNA递送系统可以与细胞表面PSMA抗原结合,具有较高的细胞亲和性;对LNcap细胞中PLK1和B7H3基因可以高效沉默;对肿瘤细胞增殖的抑制作用大于单独沉默PLK1或B7H3基因,双沉默siRNA递送系统在抑制肿瘤细胞生长方面具有协同效应。结论制备的PSMA适配子-脂质体-双siRNA递送系统具有前列腺癌细胞靶向性,且在抑癌方面可以发挥协同作用,提示了该双功能siRNA基因治疗药物系统的潜在应用性。     

用于基因转染的阳离子脂质体研究进展

开发高效、低毒、具有靶向性的基因载体是基因治疗的关键。阳离子脂质体因具有低毒性与免疫原性、生物相容性好、易于制备等优点而受到广泛关注,具有良好的应用前景。近年来,人们通过使用各种辅助性成分研发新型材料,对脂质材料进行表面修饰以及制备工艺调整等方法改进阳离子脂质体的性能。从上述几方面综述了此类基因传递载体的研究进展。     

双氨基甲酸酯键连接的阳离子类脂前体合成

随着生物化学与分子生物学理论的不断发展，基因治疗已成为医学界最活跃的研究领域之一。基因治疗载体在基因治疗过程中起一个转运和保护的作用，是基因治疗成功与否的关键。因此，基因治疗载体的开发对基因治疗的发展尤为重要，其有效开发将推动基因治疗向常规治疗方法的转变。目前，用于临床的基因载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类，它们都具有各自鲜明的优缺点，在临床治疗上亟需改进目。脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体，居第二位，是最有发展前景的非病毒载体。其中。阳离子脂质体由于具有对阴离子型聚电解质敏感。对带负电荷的DNA有较高的转运能力．还能转运RNA、核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞等优点，其转染效率比其他脂质体高出许多倍。因而被广泛应用于基因转移技术中。在阳离子类脂的结构中。连接键是一个非常重要的组成部分。它直接决定了阳离子脂质体的化学稳定性及被生物降解的能力，进而影响阳离子类脂的转染效率和细胞毒性141。现在已合成出来的用于基因治疗的阳离子脂质体的连接键主要有醚键（如DOTMA、DMR．IE）IS．-91和酯键（如DOTAP）两种。前者由于过于稳定，在完成转染任务后不易分解。遗留在细胞内部对细胞产生毒害；而后者由于不够稳定，在转染过程中就易分解，对细胞的转染效率产生不利影响。 因此．本课题组设计了以氨基甲酸酯键作为连接键的阳离子类脂．通过改变类脂前体分子中碳链长度、类脂分子合成中卤代烷碳链长度和卤素的类型来得到一系列的阳离子类脂，计划利用其pH敏感性和细胞内外的pH值差别，使在细胞外稳定的阳离子类脂在进入细胞内完成转染任务后可以分解成小分子有机物顺利排出，从而达到较好的转染效率和较低的细胞毒性旧。     

稳定表达Ag85A蛋白细胞系的建立

目的建立稳定表达Ag85A蛋白的K562真核细胞系,为进一步开展以阳离子脂质体为转运载体的口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。方法将已构建的重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A包裹阳离子脂质体LipofectamineTM 2000后,转染真核细胞K562,SDS-PAGE和Western blot分析重组Ag85A蛋白的表达。用G418筛选稳定表达Ag85A蛋白的细胞株,流式细胞术和间接免疫荧光技术检测Ag85A蛋白的表达及定位。结果重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A转染K562细胞时,与脂质体的最适比例为2μg:2μl;转染细胞表达的Ag85A蛋白相对分子质量约为32000,且具有良好的反应原性。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞有42.37%的细胞显示FITC标记,且细胞胞浆中及细胞膜上均有Ag85A蛋白的表达。结论已获得稳定表达Ag85A蛋白的K562细胞系,可用于Ag85A蛋白的大量制备及抗体方面的研究。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。