重组CD13单链抗体和蝎毒素多肽AGAP融合蛋白真核表达及对NB4 细胞的靶向杀伤作用

目的: 本研究应用基因工程技术方法, 构建含重组编码CD₁₃单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽(analgesic antitumoral peptide, AGAP) 融合蛋白基因的表达载体, 并研究CD₁₃-AGAP 融合蛋白对CD₁₃ 阳性白血病细胞NB4 影响。方法: 克隆东亚钳蝎活性肽AGAP 的基因, 插入真核表达载体pSecTag2 /CD₁₃ /RFP, 得到pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP重组真核表达载体。酶切及测序鉴定后, 脂质体介导重组质粒转染293T 细胞, 通过RT-PCR 和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白的表达。纯化融合蛋白, 作用NB4 细胞, CCK8 检测细胞活性, 流式细胞仪检测细胞周期。结果: 酶切及测序结果证实pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP 重组真核表达载体构建成功, 转染293T 细胞后, RT-PCR 和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达, 并纯化真核表达融合蛋白CD₁₃-AGAP 对血液肿瘤CD₁₃阳性白血病细胞NB4 有一定的生长抑制作用, 并且使细胞周期G₁ 期阻滞, S 期减少。结论: 成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2 /CD₁₃ /AGAP, 并在293T 细胞中成功表达, 进一步证实融合蛋白对CD₁₃阳性白血病细胞NB4 有杀伤作用。     

大鼠核因子-κB 反义 RNA 腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的: 构建表达大鼠核因子 κB(NF-κB, p65)反义 RNA 的重组腺病毒, 并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs) 中 NF-κB 基因的表达变化。方法: 从自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)的VSMCs 中提取总 RNA, 经 RT-PCR 方法获得含全部编码序列的NF-κB (p65) cDNA 片段(1 653 bp), 用TA 克隆技术插入 pMD18-T 载体, 构建 pMD18-T/1653 重组质粒, 并经酶切和 DNA 测序鉴定。以该质粒为模板, 经 PCR 获得 NF-κB(p65) 3' 端 269 bp 片段, 逆向插入 pcDNA3.1(+) 真核表达载体并置于CMV 启动子下。由此构建的 pcDNA3.1(+)/269 质粒含有NF-κB(p65) 的269 bp反义RNA 完整表达框。随后将该表达框克隆到入门载体 pENTR4, 构建重组质粒 pENTR4/CMV/269。使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体 pAd/PL-DEST, 最终得到重组腺病毒质粒 pAd/CMV/269。线性化的重组腺病毒质粒转染 293细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs 的感染。Western Blot 测定感染前后VSMCs 中NF-κB(p65) 表达的变化情况。结果: 构建的pMD18-T/1653 重组质粒经过序列测定, 证实其包含大鼠NF-κB(p65) 基因的 1653 bp 片断;pcDNA3.1(+) /269、pENTR4/CMV/269、pAd/CMV/269 等重组质粒经内切酶消化或 PCR等方法鉴定无误;线性化的 pAd/CMV/269 转染 293 细胞后, 可产生完整 、具有感染性的重组腺病毒颗粒, 病毒在感染上清中的滴度 为 9.23 ×10⁹ pfu°ml^-1 (plaque form units permilliliter);Western Blot 检测证实, 感染重组腺病毒的VSMCs中的NF-κB(p65) 蛋白水平明显减少。结论: 构建了可表达大鼠 NF-κB (p65) 反义 RNA 的重组腺病毒 Ad/CMV/269, 该病毒在受染的 VSMCs 内具有下调 NF-κB (p65) 基因表达的生物学功能, 为后续的基因治疗研究奠定基础。     

利用RTS500 系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的: 构建含目的基因葛佬素(gloverin) 的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapid translationsystem) 对其进行表达。方法: 采用PCR 方法扩增葛佬素cDNA, 将其与表达载体pIVEX2.3 连接;采用PCR 及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500, 使其蛋白能在大肠杆菌(E. coli) 裂解产物中进行表达。应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定。结果: pIVEX2.3-G 重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500 可表达出分子量约为14.4 的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论: 抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达。     

pFLAG-AMPKα2真核表达质粒构建及对心肌缺氧/复氧损伤的作用

目的: 构建大鼠pFLAG-AMPKα2真核表达质粒,分析AMPKα2过表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响。方法: 提取H9c2心肌样细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增AMPKα2基因的cDNA全长,并将其克隆至pFLAG-CMV-4构建pFLAG- AMPKα2重组质粒。转染pFLAG-AMPKα2至H9c2细胞,Western Blot测定AMPKα2的蛋白表达情况,建立缺氧/复氧(A/R)损伤模型,MTT法检测心肌细胞的存活率,生物自动分析仪检测LDH活性,流式细胞术检测各实验组心肌细胞凋亡程度、细胞内ROS的变化,试剂盒检测细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性。结果: AMPKα2全长基因序列克隆至真核表达载体pFLAG-CMV-4,酶切鉴定片段大小为1700 bp,Western blot检测转染pFLAG-AMPKα2后,AMPKα2蛋白在H9c2细胞中高表达。H9c2细胞遭受A/R损伤,心肌细胞存活率下降,LDH活性增加,细胞凋亡加重,ROS生成增加,SOD及GSH-Px的酶活性下降,pFLAG-AMPKα2重组质粒的导入可明显逆转、改善上述各项指标,从而对抗A/R损伤。结论: 构建成功的pFlAG- AMPKα2重组质粒能对抗A/R所致的心肌细胞损伤,其机制与改善心肌细胞的氧化应激作用有关。     

脑梗死患者血浆胆固醇酯转运蛋白水平及其基因两种主要突变的检测

目的 检测脑梗死患者和正常人的胆固醇酯转运蛋白(CETP) 基因15 外显子D442G 突变和14 内含子I14A 突变的频率。方法 应用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析(PCR-RFLP) 的方法检测110 例脑梗死患者和100 例健康人胆固醇酯转运蛋白基因D442G 突变和I14A 突变;用本室建立的酶联免疫测定法(ELISA) 测定其血浆CETP 水平。结果 110 例脑梗死患者中发现4 例D442G杂合子, 1 例I14A 杂合子, 无纯合子, 突变率分别为3.6%、0.9%;100 例健康人中发现4 例D442G杂合子, 1 例D442G 纯合子, 1 例I14A 杂合子, 突变率分别为5%、1%, 两组相比较突变频率的差异无统计学意义(P>0.05);而脑梗死组TC、CETP 水平明显高于正常组(P<0.05), TG、LDL-C、apoB 水平与正常组相比差异性极其显著(P<0.005),HDL-C、apoAI 水平则显著低于正常组(P<0.005)。结论 脑梗死患者血脂和脂蛋白谱表现较强的动脉粥样硬化性, CETP 水平明显升高;CETP 基因突变频率与正常组比较无显著差异。     

CYP2C19基因多态性真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

目的: 构建细胞色素P450 CYP2C19^*1、^*2、^*3真核表达载体,并分别转染人肝癌细胞(HepG2),建立高表达目的基因的稳定转染细胞系。方法: 应用化学合成法合成CYP2C19^*1(野生型)序列,再以此为模板,体外定点突变PCR法构建^*2、^*3(突变型)。DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.l(-),经菌落PCR、酶切以及测序鉴定后,脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,RT-PCR、Western Blot 分别检测CYP2C19^*1、^*2、^*3 mRNA以及蛋白的表达。结果: 成功构建了pcDNA3.1(-)-CYP2C19^*1、^*2、^*3表达质粒,并建立了相应稳定转染细胞系。进一步的RT-PCR和Western Blot检测结果表明,目的基因均得到了稳定的表达。结论: 人CYP2C19^*1、^*2、^*3稳定表达细胞系为研究创新药物或新药先导化合物临床前代谢性质的筛选和预测以及为临床潜在药物相互作用提供了有效实验平台。     

重组副腺病毒介导的大鼠星状细胞激活相关蛋白基因转染对大鼠肝星状细胞表达间质胶原酶mRNA的影响

目的: 研究重组副腺病毒介导的大鼠星状细胞激活相关蛋白（stellate cell activation-associated Protein, STAP) 基因 转染对 大鼠肝 星状细 胞表达 间质肢原酶mRNA的影响。方法: 构建并制备rAAV/iSTAP病毒载体。链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注法分离纯化SD大鼠肝星状细胞,转染HSC,用半定量RT-PCR法研究对肝星状细胞表达间质胶原酶mRNA的影响。结果: rAAV/rSTAP转染可提高大鼠肝星状细胞表达间质胶原酶Mma的水平。结论: 间质胶原酶与肝纤维化形成密切相关,rAAV/rSTAP转染可提高大鼠肝星状细胞表达间质胶原酶mRNA的水平,提示rAAV/rSTAP上调大鼠肝星状细胞间质胶原酶mRNA的表达水平可能是其抗纤维化的机理之一。     

染料木素临床不良反应与CYP1A2、UGT1A7基因多态性研究

目的:探讨染料木素临床不良反应与CYP1A2、UGT1A7基因多态性的相关性。方法:114例健康志愿者随机分为试验组与对照组,试验组分别口服染料木素一个剂量50、100、200mg,每人服药1次,观察3d了解有无不良反应发生;用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(RFLRPCR)扩增基因片段并酶切电泳观察分析CYP1A2G2964A、C734A和UGT1A7Trp208Arg的多态性。结果:试验组及对照组的基因型及等位基因分布差异无统计学意义(P>0.05)。试验组受试者根据有无不良反应的出现分为两组基因,CYP1A2G2964A基因:不良反应组14例受试者中有10例的基因型为G/A(占71.43%),而无不良反应组41例受试者中有22例的基因型为G/G(占53.66%);CYP1A2C734A基因:不良反应组13例受试者中有7例的基因型为C/A(占53.85%),而无不良反应组32例受试者中有16例的基因型为A/A(占50.00%);UGT1A7Trp208Arg基因:不良反应组15例受试者中有12例的基因型为Trp/Trp(占80.00%),并且无不良反应组53例受试者中有32例的基因型也为Trp/Trp(占60.38%)。结论:染料木素不良反应组中CYP1A2G2964A基因以G/A型较高,CYP1A2C734A基因以G/G型较高;UGT1A7基因以TrpTrp型较高。     

不同基因型丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的研究

目的: 建立丙型肝炎病毒(HCV) NS3蛋白细胞表达模型,研究不同基因型丙型肝炎病毒端粒酶活性之间是否存在差异。方法: 筛选出不同HCV 基因型。分别运用PCR法扩增HCV NS3蛋白基因,转载真核表达载体pBK-CMV,构建重组质粒pBK-HCV NS3,分别导入肝癌细胞株HepG2,采用端粒重复序列扩增(TRAP)方法检测不同基因型HCV NS3蛋白基因转载质粒导入HepG2细胞的端粒酶活性。结果: 本地区HCV基因型流行的主要是1b型,其次是2a型。转染不同基因型HCV NS3蛋白基因的HepG2细胞端粒酶活性较转染空载质粒的细胞明显升高;不同基因型HCV端粒酶活性之间存在差异,HCV 1b型的端粒酶活性明显高于HCV 2a型。结论: HCV NS3蛋白可能以某种机制激活了端粒酶活性。不同基因型HCV NS3蛋白在细胞恶性转化中的影响有差异。     

组织激肽释放酶基因多态性A1789G对高血压患者血浆肌酐水平的影响

目的: 探讨组织激肽释放酶基因多态性对高血压患者血浆肌酐水平的影响。方法: 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 方法对733 例高血压患者的组织激肽释放酶基因A1789G多态位点进行基因分型, 用线性回归模型分析基因型与血浆肌酐水平之间的关系, 用方差分析分析基因型和血压对血浆肌酐水平的交互影响。结果: 携带突变型等位基因1789G(基因型AG 或GG) 高血压患者较携带野生型等位基因A1789(基因型AA) 患者的血浆肌酐水平明显升高, 且血浆肌酐水平随着血压的升高而升高。结论: 组织激肽释放酶基因多态性对高血压患者的血浆肌酐水平产生明显影响,A1789G 多态位点是高血压患者血浆肌酐清除率下降的一个危险因素。     

丙氧鸟苷结合HSV-TK基因治疗乳腺癌的实验研究

目的:探讨丙氧鸟苷(GCV)结合HSV-TK 基因对人乳腺癌细胞系体外及体内杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法:采用脂质体转染法将GINaTK 载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染人乳腺癌细胞, 得到带有HSV-TK 基因的TK 细胞, 并将其分别用于体外和体内实验。结果:体外实验结果显示, 当TK 细胞数占混合细胞10%时, 低浓度(10 μg/mL)的GCV 就可将50%左右的肿瘤细胞杀死。体内实验结果显示GCV 可明显抑制TK 细胞在BALBPC 小鼠体内的肿瘤形成。经GCV 治疗后, 肿瘤体积分别较对照组缩小约11.1%、30.6% 和47.2%(P<0.01);实验组肿瘤组织与对照组相比存在明显的病理学改变。结论:逆转录病毒可介导HSV-TK 基因转入小鼠乳腺癌细胞并获稳定表达, GCV 结合HSV-TK 基因在体内外对乳腺癌细胞均有杀伤作用, 且存在明显的旁观者效应。     

干扰素、病毒唑抗呼吸道合胞病毒的体外观察

目的 观察重组人干扰素、病毒唑单独及联合体外抗呼吸道合胞病毒(RSV) 的效果。方法 细胞病变抑制法, 即测定药物单独及联合应用对RSV 所致细胞病变的抑制作用。结果 干扰素浓度≥5 IU·ml^-1或病毒唑浓度≥24 μg·ml^-1时, 随着药物浓度的增加、抑制细胞病变的作用也增强, 直至不出现细胞病变(P <0.01); 两药在低于各自的有效浓度时合用, 即干扰素1 IU·ml^-1、病毒唑12 μg·ml^-1, 仍具有明显的抑制细胞病变作用(P ≤0.01)。结论 重组人干扰素及病毒唑体外均有抗RSV 作用, 联合应用时作用更甚。     

携带Kringle 5 基因重组腺病毒的构建及其对荷肺癌小鼠生存期的作用

目的 构建携带人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因重组腺病毒并观察其在小鼠肺癌细胞中的表达和对荷TC-1 瘤小鼠的生存期的影响。 方法 构建携带人纤溶酶原K5 基因表达框的腺病毒载体Ad-EF1α-K5, 用RT-PCR 法检测腺病毒感染TC-1细胞后K5 mRNA 的表达, 用免疫沉淀和Westernbloting 法检测腺病毒感染TC-1 细胞后K5 蛋白的表达。建立荷TC-1 小鼠肺癌C57BL/6 小鼠模型,观察重组腺病毒对荷瘤小鼠生存期的影响。取肿瘤组织做免疫组织化学染色并计数微血管密度。 结果 携带K5 基因的人V 型腺病毒能有效感染小鼠肺癌TC-1 细胞, 在转录和翻译水平进行表达, 能有效延长荷瘤鼠的生存期并降低肿瘤微血管密度。 结论 腺病毒可作为便捷的载体携带K5基因感染肿瘤细胞, 分泌表达K5 蛋白, 延长荷瘤小鼠生存期, 可能与其通过抑制肿瘤区血管生成、遏制肿瘤区血供有关。     

豆腐果苷对人孕烷X 受体介导的CYP3A4 和MDR1 的转录调节作用

目的 建立和验证人孕烷X 受体(humanpregnant X receptor, hPXR) 介导的CYP3A4 、MDR1药物诱导剂的体外筛选体系, 考察豆腐果苷对hPXR 介导的CYP3A4 、MDR1 的转录调节作用。方法 利用构建的双荧光素酶报告基因系统, 将表达载体和报告载体共转染HepG2 细胞, 以10 μmol/L 利福平为阳性对照, 用不同浓度(0.004 、0.04 、0.4 μmol/L) 豆腐果苷处理48 h 后裂解细胞进行双荧光素酶活性检测。结果 不同浓度的豆腐果苷均不能通过激活hPXR 来介导CYP3A4 和MDR1 表达上调, 各浓度处理组的双荧光素酶比活性值与DMSO 溶媒组差异无统计学意义(P >0.05)。结论 成功构建了hPXR 介导的CYP3A4 和MDR1 药物诱导剂的体外筛选体系, 并发现豆腐果苷不能通过激活hPXR 介导CYP3A4和MDR1 的表达上调。     

抗病毒新药17997 抗病毒效应的细胞微量量热的研究

目的 研究抗病毒新药17997 对细胞代谢的影响和抑制病毒复制时细胞热效应的变化。方法 利用微量量热的方法。结果 热代谢曲线表明, 在有效抑制病毒复制浓度下, 17997不影响宿主细胞的正常代谢, 且能明显地降低病毒复制时的细胞热代谢。结论 17997 能够抑制病毒复制, 对宿主细胞的热代谢没有影响。