辐射诱导增强p53重组腺病毒转染对人结直肠癌细胞的抑制

探讨了辐射诱导对p53重组腺病毒载体转染p53突变型结直肠癌细胞(HT-29细胞系)的影响.以复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMV-GFP)为对照,用复制缺陷型p53重组腺病毒载体(AdCMV-p53)转染经0.5、1.0、2.0 Gy γ射线照射的HT-29细胞,用流式细胞分析法检测细胞凋亡和p53蛋白表达,并用克隆形成法测定细胞增殖能力.结果表明,0.5 Gy辐射诱导明显提高了AdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制,促进细胞凋亡.0.5Gy辐射诱导对AdCMV-p53转染HT-29细胞的抑制杀伤的增强作用最强,0.5 Gy辐射诱导及40 MOI和80 MOIAdCMV-p53转染对肿瘤的抑制率比同等剂量下单纯转染组分别提高约50%和20%,比0.5 Gy单纯辐照组提高40%.因此,0.5 Gy辐射诱导可有效增加低于80 MOI AdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制作用.辐射诱导AdCMV-p53转染HT-29细胞以最大辐射剂量不超过1.0 Gy及AdCMV-p53转染量低于80MOI为宜.     

辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.     

辐射诱导p53腺病毒重组体转染对结直肠癌细胞周期的影响

以复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMV-GFP）为对照,用复制缺陷型p53重组腺病毒载体（AdCMV-p53）转染经0．5、1．0、2．0Gyγ射线照射的HT-29细胞,克隆形成法检测对细胞的抑制作用,流式细胞分析法检测细胞周期和细胞凋亡,探讨辐射诱导对AdCMV-p53转染p53突变型结直肠癌细胞（HT-29细胞系）细胞周期的影响。结果显示,0．5—1．0Gy辐射诱导明显增强40MOIAdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制。与AdCMV-p53转染对照相比,1d后,辐射诱导转染组G0／G1期细胞减少5％-15％,s期细胞增加2％-19％,2．0Gy辐射诱导80MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞增加12％;3d后,0．5、1．0Gy辐射诱导40MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞分别增加10%-13％。辐射诱导AdCMV-p53转染组细胞凋亡与辐射诱导剂量和AdCMV-p53转染剂量相关。以上结果表明,辐射诱导加速AdCMV-p53转染细胞由Go／G1期到S期的进程,促进S期阻滞和G2／M期阻滞发生。     

重组人p53腺病毒注射液联合放射治疗对人淋巴瘤细胞的影响

为探讨重组人p53腺病毒(rAd p53)注射液联合放射治疗对人淋巴瘤细胞的抑制作用及其 辐射增敏性,利用四氮唑盐(MTT)比色法分析rAd p53注射液、放射治疗以及两者联 合应用对人淋巴瘤细胞的抑制作用;应用流式细胞术分析各组细胞的细胞周期和凋亡率;通 过蛋白质的Western印迹分析法(Western blotting)分析各组淋巴瘤细胞内P53蛋白的表达 .结果表明外源性的p53基因虽然有一定程度的转染,但未见高效表达,rAd-p53注射液对人淋巴瘤细胞的抑制作用及辐射增敏性均不显著.     

受辐射肝癌细胞所诱导旁效应与p53的关系

通过检测受照射细胞及与其共培养旁细胞的损伤情况及p53抑制剂对其的影响,研究了肝癌细胞辐射敏感性及辐射诱导的旁效应与p53的关系.发现肝癌细胞的辐射敏感性与p53密切相关:野生型p53辐射敏感性最高,突变型的次之,缺失型的敏感性最低.同时,辐射诱导的旁效应与p53状态亦密切相关,仅野生型p53肝癌细胞(HepG2)对旁细胞(chang氏肝细胞)具有旁效应,且未受照射旁细胞中产生的微核具有明显的剂量效应和时间效应;而突变型(PLC)和缺失型(Hep3B)的肝癌细胞几乎不能诱导辐射旁效应的产生.另外,p53抑制剂可显著抑制辐射旁效应的产生.     

P53基因、Bcl-XL基因表达对淋巴性肿瘤细胞株辐射敏感性的影响

本文运用PCR－SSCP银染法检测人淋巴细胞恶性肿瘤株8226、U266、Raji、Jurkat、Daudi p53基因状态,RT－PCR半定量检测了Bcx-xL的mRNA的相对表达,DNA片段释放法检测细胞受照后24h的细胞DNA链断裂量,探讨了p53基因功能状态及Bcl-xL基因表达对细胞株8226、U266、Raji、Jurkat、Dsaudi辐射敏感性的影响。结果表明,淋巴细胞恶性肿瘤株8226、U266、Raji、Jurkat、Daudi均存在p53基因突变,高表达Bcl-xL基因的细胞株较低表达细胞株有较强的辐射耐性。     

RNAi抑制人宫颈癌细胞HSF1基因表达增强细胞辐射敏感性的实验研究

通过RNA(Ribonucleic acid)干扰技术下调人宫颈癌细胞中热休克转录因子HSFI(Heat shock tran-scriprion factor1,HSF1)基因的表达,探讨沉默HSF1基因后,对宫颈癌细胞辐射敏感性的影响.将表达siRNA的HSF1-pSilencer2.1-U6 neo质粒表达载体,采用脂质体转染法转入宫颈癌细胞,用实时荧光定量PCR(Realtime polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HSF1mRNA表达水平,流式细胞仪检测蛋白质量,克隆法检测细胞的辐射敏感性.结果发现,与空白组细胞及阴性对照组细胞相比转染HSF1A-pSilencer2.1-U6neo质粒表达载体的细胞HSF1mRNA表达明显下降,同时Hela细胞的辐射敏感性也随着HSF1基因表达的下调而增高.表明siRNA质粒表达载体HSF1A-pSilencer2.1-U6neo转染细胞后可以降低HSF1的表达,可以增强宫颈癌细胞的辐射敏感性,具有良好的临床应用前景.     

增加UHRF1的表达降低乳癌细胞的放射敏感性

为了了解基因UHRF1(ubiquitin-like,containing PHD and RING finger domains,1)基因对乳癌细胞的生长、增殖和辐射敏感性的影响,将全长UHRF1基因的cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,通过脂质体介导转染入乳癌细胞MDA-MB-231,筛选出UHRF1高表达的细胞株.借助生长曲线、集落形成实验,研究基因转染细胞的生长、增殖能力;通过γ射线辐照后的集落形成实验,观察基因转染对细胞辐射敏感性的影响.实验结果显示,与MDA-MB-231母细胞和转染了pcDNA3"空"质粒的MDA-MB-231/pcDNA3细胞相比,转染有UHRF1基因的MDA-MB-231/UHRF1细胞的生长率和克隆形成率都未有明显改变,但细胞的辐射敏感性明显降低,这些结果首次揭示人类UHRF1基因的表达水平并不影响乳癌细胞MDA-MB-231的生长和增殖能力,但可以调节其辐射敏感性,具体机制有待进一步深入研究.     

pEgr-sTRAIL体外转染联合~(60)Co γ射线照射诱导肿瘤细胞凋亡及Caspase-3活化

为探讨Egr-1启动子调控TRAIL基因表达的辐射增敏作用及其作用机制,采用体外瞬时转染pEgr-sTRAIL辐射诱导表达载体联合不同剂量60Coγ射线照射,观察其诱导肿瘤细胞凋亡的作用及其与凋亡执行分子Caspase-3活化的关系。结果表明重组质粒体外瞬时转染联合不同剂量60Coγ射线照射可诱导肿瘤细胞凋亡,并具有随剂量增高而增加的趋势。Western blot及分光光度法检测Capase-3活性均显示转染重组质粒pEgr-sTRAIL接受不同剂量γ射线照射后,其Caspase-3活性明显增高,亦有随着剂量增高而增高的趋势。提示γ射线可通过激活Egr-1启动子增加TRAIL诱导凋亡及活化Caspase-3的作用从而提高肿瘤细胞的辐射敏感性。     

pEgr-ssEndostatin的构建及其在体外的辐射诱导表达

为探讨pEgr-ssEndostatin重组质粒转染B16细胞后接受不同辐射剂量以及接受同一剂量不同时程endostatin表达的规律。采用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Endostatin cDNA,连入信号肽,构建了pEgr-ssEndostatin重组质粒,用脂质体介导的转染法转染小鼠B16细胞,用ELISA方法检测B16细胞上清中endostatin的表达水平。结果表明的分泌型Endostatin序列与报道完全一致,Egr-1启动子和Endostatin cDNA正确插入表达载体pcDNA3．1;pEfr-ssEndostatin具有辐射诱导表达特性。提示小鼠Endostatin基因成功地被克隆和表达,Egr-1启动子具有辐射激活和诱导下游基因表达增强的功能。     

放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统慢病毒载体的构建及125I诱导表达的研究

合成了含8个CArG元件的放射敏感性启动子E8,将其连接于胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase, CD）基因及GFP报告基因上游,构建了重组慢病毒载体pGC-FU-E8-codA-GFP。与慢病毒包装系统共转染293T细胞包装重组慢病毒颗粒E8-codA-GFP LV,研究重组慢病毒感染EJ细胞在不同剂量¹²⁵I的电离辐射下绿色荧光表达情况及其将5-FC转化为5-FU的能力。结果显示：构建的含有E8启动子及CD基因的重组慢病毒载体,包装的重组慢病毒滴度为2×10⁸TU/mL;经¹²⁵I照射的重组慢病毒感染EJ细胞均可观察到绿色荧光,其细胞上清液均可检测到5-FC转化成的5-FU紫外峰,其中55.5 kBq及74.0 kBq ¹²⁵I照射的细胞组绿色荧光明显,148 kBq ¹²⁵I照射的细胞组,其5-FU紫外峰最为明显。以上结果表明：本工作所构建的放射敏感性启动子调控CD基因/5-FC自杀系统重组慢病毒载体具有电离辐射调控作用,可在¹²⁵I的电离辐射作用下诱导下游基因表达,为放射性核素¹²⁵I联合CD基因/5-FC自杀系统对肿瘤细胞的治疗作用研究提供了实验基础。     

Human sodium/iodide symporter gene induced iodine uptake in human lung adenocarcinoma via baculovirus

To investigate human sodium/iodide symporter (hNIS) induced iodine uptake in human lung adeno- carcinoma via baculovirus, a recombinant baculovirus encoding hNIS gene was constructed under the control of CMV promoter (Bac-CMV-hNIS). In vitro, baculovirus infected A549 cells accumulated about 27 times more 125I than that of noninfected cells. The 125I uptake was maximal after 30-min incubation of the cells, and efflux of the radioactivity was rapid, with 50% lost during the first 2 min after 125I-containing medium had been replaced by nonradioactive medium. Competition experiments in the presence of sodium perchlorate revealed a dose-dependent decrease of 125I uptake. Bac-CMV-hNIS infected tumor cells were selectively killed by exposure to 131I, as revealed by clonogenic assays. In nude mice, Bac-CMV-hNIS infected A549 cells accumulated more 131I than that of the control monitored by 1-h scintigraphy after 131I administration. The transduction of hNIS gene through baculovirus is sufficient to induce iodine transporting in A549 cells in vitro and in vivo, outlining the potential of this novel tumor gene imaging approach. But a rapid efflux of radioactivity from the tumor was shown in vivo and the in vivo therapy test showed no sign of effect.     

Effect of p53 on lung carcinoma cells irradiated by carbon ions or X-rays

The study is to investigate the feasibility and advantages of heavy ion beams on radiotherapy. The cellular cycle and apoptosis, cell reproductive death and p53 expression evaluated with flow cytometry, clonogenic survival assays and Western blot analysis were examined in lung carcinoma cells after exposure to 89.63 MeV/u carbon ion and 6 MV X-ray irradiations, respectively. The results showed that the number colonyforming assay of A549 was higher than that of H1299 cells in two radiation groups; A549 cellular cycle was arrested in G2/M in 12 h and the per-centage of apoptosis ascended at each time point of carbon ion radiation with doses, the expression of p53 upregulated with doses exposed to X-ray or carbon ion. The cell number in G2/M of H1299 and apoptosis were increasing at all time points with doses in 12C6+ ion irradiation group. The results suggested that the effects of carbon ions or X rays ir-radiation on lung carcinoma cells were different, 12C6+ ion irradiation could have more effect on upregulating the ex-pression of p53 than X-ray, and the upregulated expression of p53 might produce the cellular cycle G2/M arrested, apoptosis increasing; and p53 gene might affect the lung cancer cells radiosensitivity.     

腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取~(131)I-FIAU的实验研究

用内部核糖体进入序列(IRES)将报告基因单纯疱疹I型病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)连接,双启动子法将TK-IRES-BDNF与增强绿色荧光蛋白(EGFP)包装到重组腺病毒载体中,得到Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,扩增、纯化、测定病毒滴度;以感染复数(MOI)为0、50、100、150、200、250感染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),以重组腺病毒Ad5-EGFP为无效对照病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的绿色荧光细胞阳性率。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染细胞增殖能力。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)诱导感染细胞向神经元细胞分化,显微镜下观察细胞形态变化。实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和2-△△CT法分析两目的基因的相对表达量(CT)。观察感染细胞对131I-FIAU的摄取情况。重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在MOI为150可高效感染BMSCs,感染细胞存活率98%,且保持良好的神经元细胞诱导分化能力。RQ-PCR检测两目的基因随着腺病毒MOI增加表达增强,且TK和BNDF两基因的表达有良好的线性相关(r=0.973,P0.05,n=3)。在前3h可见感染目的基因组细胞对131I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关,3h感染目的基因组对131I-FIAU摄取率可达(31.42±0.46)%(n=3),随后增加不明显。各点感染目的基因组摄取率均显著高于对照组(t=23.06–173.83,P0.05,n=3)。重组腺病毒载体能高效、低毒感染BMSCs,IRES介导两目的基因表达有良好的线性相关。本研究表明感染目的基因细胞可有效介导HSV1-TK摄取131I-FIAU,为后续放射性核素报告基因活体显像示踪转基因BMSCs治疗脑梗死提供了细胞水平依据。     

干扰ATM基因表达增强胃癌细胞AGS的放射敏感性

为探讨RNA干扰共济失调毛细血管扩张性突变(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因表达后对胃癌细胞AGS放射敏感性的影响,通过构建ATM基因RNA干扰质粒转染AGS细胞,获得干扰效率高的克隆细胞AGS-Ri-ATM,并采用RT-PCR和Western blot分别检测m RNA和蛋白表达水平,平板克隆形成实验观察细胞经放射后对细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。检测结果显示其ATM基因表达被干扰下调。经X射线照射至不同吸收剂量,AGS-Ri-ATM平板克隆形成数量/率远低于AGS-Vector的平板克隆形成数量/率,差异显著(p0.05),具有统计学意义。流式细胞术检测显示当吸收剂量为4 Gy时,AGS-Ri-ATM被阻滞在G1期,同时在12 h后出现明显的凋亡想象。结果表明,ATM基因被干扰后可以诱导细胞周期的阻滞,以及凋亡的增加而增强AGS细胞的放射敏感性。     

碱性单细胞凝胶电泳预测肿瘤细胞内在放射敏感性研究

应用克隆形成法和碱性单细胞凝胶电泳技术检测辐射诱导的人红白血病细胞株K562、人结肠腺癌细胞株LS-T-117和鼠胶质瘤细胞株C6的初始DNA单链断裂数及单链断裂后的修复与细胞内在放射敏感性之间的关系。结果表明,3种细胞系的放射敏感性依次为K562>LS-T-117>C6;3种细胞系的DNA迁移距离都随着照射剂量的增加而增大,呈良好的剂量-效应关系。在相同剂量下,辐射诱导的DNA单链的初始断裂数目也依次为K562>LS-T-117>C6;3种细胞系经10Gy X射线照射并在PBS中培养不同时间后DNA迁移距离都有较大幅度的下降,但下降幅度依次为C6>LS-T-117>K562,在相同剂量下辐射诱导的DNA单链断裂后的修复能力也依次为C6>LS-T-117> K562。结果显示,辐射诱导的DNA单链断裂及修复与细胞内在放射敏感性有很好的相关性,可用于人体肿瘤细胞内在放射敏感性的预测。     

PEI介导的E1A基因对结肠癌细胞放疗增敏效应的研究

以自行合成的聚乙烯亚胺纳米凝胶(Polyethylenimine,PEI)为载体转染E1A基因,观察E1A基凶对结肠癌细胞体外生长的抑制作用和对电离辐射的增敏效应,并初步探讨其作用机理.经PEI介导将真核细胞高效表达E1A基因的重组质粒psv-E1A导入人结肠癌细胞系SW480,RT-PCR证实其转染,G418筛选出阳...     

Radioiodide uptake in melanoma cells after transfer of human NaI symporter gene

1 Introduction Radioiodide therapy using 131I is effective for pa-tients who have metastasis from differentiated thyroidcancer. This therapy is based on the uptake of radioac-tive iodide into cancer cells, as is observed in thyroidcells, to …     

Antitumor and radiosensitization effect of 12C6+ heavy-ion irradiation mediated by radiation-inducible gene therapy

Radio genetic therapy which combines gene therapy with radiotherapy has shown promising results in cancer treatment. In this study, an oncolytic adenovirusbased gene therapy system regulated by radiation was constructed to improve the cancer curative effect. This gene therapy system incorporated the radiation-inducible early growth response gene(Egr-1) promoter and the anticancer gene tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL). To confirm the antitumor effect of Ad-ET combined with~12C~(6+)tion irradiation, the survival and apoptosis fraction of tumor cells HT1080 and normal cells MRC-5 in combination treatment were detected by CCK-8 assay and FACS analysis. Then the expression levels of TRAIL gene and protein were tested by real-time PCR and western blotting. The results show that~12C~(6+)tion irradiation could induce cell growth inhibition and apoptosis by activating the TRAIL gene expression in tumor cells, while exhibiting no obvious toxicity to the normal lung cell line MRC-5. Theresults also demonstrate that use of an oncolytic adenovirusbased radiation-inducible gene therapy system together with~12C~(6+)tion irradiation could cause synergistic antitumor effect specifically in tumor cells but not in normal cells. The results indicate that the novel radio genetic therapy could potentiate radiation treatment by improving the safety and efficiency of monotherapy, and provide theoretical support for clinical application of combination treatment.