高分泌型无赖百当烟草8306突变材料的创制与分析

8306是具有晾晒烟风格的烤烟育种材料.在前期试验中创制了NtCPS2基因突变株系8306-1,抑制了晾晒烟风格代表性物质赖百当二萜的合成.为进一步提高8306-1株系中西柏烷二萜和蔗糖酯含量(质量分数),采用基因编辑技术对8306-1株系的NtCycB2基因进行敲除,获得了纯合突变株系8306-2.与8306、830...     

烟草赖百当二萜代谢调控机制研究进展

赖百当二萜是香料烟和部分雪茄烟品种叶面分泌物中的重要组成成分,其降解产物具有强烈的龙涎香香气,对改善卷烟的香气和吸味具有重要作用。本文综述了烟草赖百当二萜的合成与代谢途径及其调控机制研究进展,并对通过现代分子生物学手段培育含有赖百当二萜的特色烤烟品种及香料物质生产等领域的应用潜力进行了展望。      

NtCycB2基因表达对烟草抗旱性的影响

NtCycB2参与调控烟草腺毛的发生与发育过程,并对多种非生物胁迫具有应答反应.为阐明NtCycB2表达对烟株耐旱性的影响,以敲除NtCycB2后的多腺毛株系ko(NtCycB2-ko)、NtCycB2过表达的少腺毛株系oe和烟草栽培品种K326为材料,使用不同浓度聚乙二醇(PEG-6000)在试管中模拟干旱胁迫,同时...     

LEU2基因敲除对工业啤酒酵母高级醇生成量的影响

通过敲除啤酒酵母中β-丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2),研究该基因对工业啤酒酵母高级醇特别是异戊醇生成量的影响.通过醋酸锂一步转化法,将一段两端具有LEU2摹因序列同源区,中间为遗传霉素(G418)抗性基因的DNA片段转入酵母细胞中,与LEU2基因的ORF(open reading flames)进行同源重组,利用遗传霉素抗性进行筛选.将突变株与出发菌株进行发酵实验,测定其发酵性能和高级醇的生成量.筛选获得了LEU2摹因突变的工业啤酒酵母.在支链氨基酸含量较低的培养基中进行发酵测定,突变株发酵液中高级醇含量比出发菌株降低了9.97%,其中异戊醇的含量降低了11.82%,而酒精度、发酵速度等发酵性能没有明显变化.LEU2基因敲除可降低工业啤酒酵母在支链氨基酸含量较低的培养基中高级醇特别是异戊醇的生成量.     

发酵工业菌种改良中的基因敲除策略及应用

基因敲除是一种近年来新发展起来的分子生物学技术,该技术可通过多种策略使机体特定基因缺失或失活,从而对生物遗传物质有目的地进行改造,在发酵工业微生物菌种改良中发挥着重要作用.在此对基因敲除技术的常用策略加以总结和论述,对其在工业菌种改良中的应用进行了简要介绍,同时展望了这项技术的发展趋势.     

黑曲霉高效敲除体系构建及tpsA基因的敲除

为完善高效的黑曲霉工程菌10142基因敲除体系,提高其基因敲除效率,构建含有致死基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVtk)的基因敲除质粒,通过农杆菌介导的黑曲霉转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)法,使致死基因随机插入黑曲霉基因组,其阳性转化子在添加10μmol/L的5-氟脱氧尿苷的培养基上无法生长,从而得到致死基因随机插入转化子的"反向筛选"方法。利用该方法对黑曲霉海藻糖-6-磷酸合成酶进行基因敲除,结果表明阳性转子占总转化子的比例为63%。成功构建高效黑曲霉基因敲除体系。     

构建ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母用于降低糯米酒中高级醇的研究

为了降低糯米酒高级醇含量,以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株XF1的单倍体XF1a7和XF1α6为原始菌,采用Cre/loxP同源重组系统构建乙醇脱氢酶基因ADH2和类丙酮酸脱羧酶基因THI3缺失的单倍体酵母,再通过单倍体的杂交构建ADH2单基因缺失双倍体酵母XF1-A和ADH2与THI3双基因缺失的双倍体酵母XF1-AT。结果表明,重组菌XF1-A、XF1-AT与原始菌XF1的生长性能相似,菌株XF1-A和XF1-AT的基本发酵性能与菌株XF1无显著差异,菌株XF1-A酿造糯米酒中高级醇含量为522.16 mg/L,比菌株XF1低11.16%;菌株XF1-AT的高级醇含量为462.03 mg/L,比菌株XF1低21.39%。综上,ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母能够有效降低糯米酒中高级醇生成量。     

黄酒酵母ADH2、ALD2和ALD6基因敲除对黄酒中乙醛代谢的影响

以工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体2a-u3(MATa ura3)为出发菌株,研究分别敲除乙醛代谢相关酶的编码基因ADH2、ALD2和ALD6对乙醛代谢的影响。采用融合PCR技术分别构建乙醇脱氢酶编码基因ADH2敲除组件"ADH2S-URA3-ADH2X"和乙醛脱氢酶编码基因ALD2和ALD6敲除组件"ALD2S-URA3-ALD2X"和"ALD6S-URA3-ALD6X",转化N85尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后,以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标记,分别获得ADH2、ALD2和ALD6基因缺失菌株2a-A2(Δadh2)、2a-D2(Δald2)和2a-D6(Δald6)。分别将获得的工程菌与亲本菌株以及前期构建的丙酮酸脱羧酶基因PDC5缺失菌株2a-P5(Δpdc5)进行实验室规模的黄酒发酵实验。结果表明,与亲本菌株2a相比,工程菌2a-A2发酵液中乙醛含量降低了7.14%,而2a-P5发酵液中乙醛含量降低了32.68%,说明工业黄酒酵母乙醛的生成存在糖代谢途径,并且乙醛主要由丙酮酸脱羧而来;工程菌2a-D2和2a-D6发酵液中乙醛含量与亲本相比分别增加了144.91%和88.87%,说明乙醛脱氢酶是黄酒中控制乙醛降解的关键酶,而且ALD2基因在乙醛转化为乙酸过程中发挥更关键的作用。     

NtLTP2基因在烟草根系发育中的功能分析

为阐明烟草NtLTP2基因在烟草生长发育中的功能,以云烟87为试验材料,克隆了NtLTP2基因的编码区和启动子序列,分别对其进行生物信息学预测、启动子组织驱动特性分析,以及基因功能研究。结果表明NtLTP2基因编码区全长294 bp,编码97个氨基酸;NtLTP2具备nsLTP2和AAI-LTSS超家族保守域,蛋白质三级结构包含1个由4个α-螺旋组成的脂质疏水腔。烟草NtLTP2为根部优势表达基因,其启动子能够驱动下游基因在烟草根部特异表达。NtLTP2过表达烟草株系的侧根数目约为对照的2倍,根系的总长、总表面积和总体积均显著增加,并且地上部分的生长发育明显优于对照。     

NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

烟草腺毛是烟草表皮细胞的特化结构,对烟株抗性及烟叶品质具有重要影响。为探索烟草腺毛密度的分子调控途径,本文对烟草B型细胞周期蛋白基因NtCycB2进行了同源克隆和生物信息学分析,并对其表达特性和生物学功能进行研究。结果表明该基因包含333bp的编码区,编码110个氨基酸,该序列在栽培烟草不同类型、不同品种间高度保守,但与SlCycB2和AtCycB2同源性分别为71.05%和52.38%。RT-PCR分析表明NtCycB2在叶面腺毛和花中的表达水平较高,并受到盐、温度、MeJA等逆境信号的诱导;分别利用基因过表达和基因编辑技术获得了NtCycB2过量表达和敲除株系;植株腺毛形态学观察发现NtCycB2过表达植株腺毛密度显著减少,基因敲除植株分泌型腺毛密度显著增加,而非分泌型腺毛变化不大,该研究表明NtCycB2对烟草分泌型腺毛发生具有明显的负调控作用,在烟草腺毛密度分子调控和叶面化学定向改良中具有较大潜力。      

过表达TaGS1/TaGS2对烟草氮素吸收的影响

  目的  为揭示小麦氮素同化关键酶谷氨酰胺合成酶（TaGS1/TaGS2）在烟草中过表达对烟草氮素吸收同化能力的影响及其机制。  方法  以烟草栽培品种K326为对照,测定分析过表达TaGS1/TaGS2烟草的生长及氮代谢指标;利用转录组结合进化树分析,确定烟草硝酸转运蛋白家族（NtNRT/NPF）及其表达水平。  结果  过表达TaGS1/TaGS2烟草根系发达、叶片变大,氮素吸收同化积累显著升高;在烟草中鉴定到36个NtNRT/NPF家族基因;过表达TaGS1/TaGS2引起其中28个NtNRT/NPF家族基因表达变化,与qRT-PCR结果一致。  结论  过表达TaGS1/TaGS2可能通过提高NtNPF6.3、NtNRT3.1、NtNPF7.3等NtNRT/NPF家族基因表达,促进烟草氮素吸收、同化与积累,为烟草生长发育提供充足氮源。      

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

【目的】探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。【方法】以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。【结果】（1）共获得6株T0代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T1代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T1代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。【结论】定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。     

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.7基因的克隆、亚细胞定位及表达模式分析

为研究硝酸转运蛋白(Nitrate transporter, NRT)在烟草吸收和转运硝酸盐中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长1 839 bp、编码612个氨基酸的硝酸盐转运蛋白基因,命名为NtNRT1.7。生物信息学分析表明烟草NtNRT1.7具有典型跨膜结构域。同源性分析结果显示,NtNRT1.7与拟南芥AtNRT1.7的同源性达57.23%。亚细胞定位结果表明该蛋白定位在细胞膜上,是一个典型的膜蛋白。启动子分析和不同胁迫处理的qRT-PCR结果显示,NtNRT1.7主要在成熟叶中高表达,并受低氮诱导抑制表达,受干旱、低温、高盐等胁迫诱导增强表达,表明NtNRT1.7基因可能参与非生物胁迫条件下硝酸盐的再利用。      

NtSPX4基因敲除对烟草苗期磷吸收和生长发育的影响研究

[目的]为探究NtSPX4基因在烟草磷吸收转运中的作用.[方法]同源克隆了烟草(Nicotiana tabacum L.)K326中NtSPX4基因,通过CRISPR/Cas9技术获得了NtSPX4-1和NtSPX4-2均发生纯合突变的K326株系S42,在不同磷浓度的Hoagland溶液培养条件下,对S42株系的生长...     

烟草NtMHX1和NtMHX2基因的克隆及不同金属离子胁迫下的表达模式分析

[目的]研究Magnesium proton exchangers (MHX)基因在烟草(Nicotiana tabacum)中的特性与功能.[方法]采用同源克隆方法,从栽培烟草K326中克隆MHX基因,对其编码蛋白进行了生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测MHX基因在不同烟草组织及金属离子处理0d、1d、2d、...     

Effect of a global regulatory gene, afsR2, from Streptomyces lividans on avermectin production in Streptomyces avermitilis

The global regulatory gene, afsR2, from Streptomyces lividans was previously reported to highly stimulate two structurally unrelated antibiotics, actinorhodin and undecylprodigiosin, in both S. lividans and its close relative S. coelicolor. Production of eight avermectin components was also improved in S. avermitilis: the use of wild-type S. avermitilis and its high-producing mutant, transformed by introduction of multiple copies of afsR2, increased the total avermectin productions by 2.3-fold and 1.5-fold, respectively.     

NaOH-H2O2溶剂体系下玉米秸秆的组分分离规律研究

研究了NaOH-H2O2组成的碱溶剂体系对玉米秸秆的溶解规律,并结合酸沉、醇析方法分离出了3种主要成分,研究了过氧化氢浓度、pH、液固比、温度、时间对玉米秸秆组分分离过程的影响。结果表明:碱溶剂处理后的剩余固体物质是纤维素和不溶物,滤液经酸沉后的固体为木质素,酸沉后的滤液调pH后醇析所得的固体为半纤维素。试验确定了分离过程的最佳工艺条件:过氧化氢浓度5%,pH=12,反应时间3 h,溶解温度60℃,液固比30 m L/g。在此条件下,纤维素回收率84.2%,木质素回收率为66.6%,半纤维素回收率96.7%,滤液经4次循环使用,纤维素回收率82.7%,木质素回收率67.6%,半纤维素回收率97.4%。碱处理及酸沉、醇析后剩余固体的结构分析证明了此方法的可行性。