烟草rbcS启动子的克隆与活性鉴定

为了有效启动外源基因在烟草叶部特异性表达并改良烟叶品质,采用PCR技术从烟草栽培种NC89基因组中分离了rbcS启动子序列,扩增片段长度979 bp.HantCARE序列分析表明,该序列中含有启动子特征的保守序列及十几种光应答元件,与已报道序列的相应区域同源性达99%.将其与GUS融合蛋白基因串连,构建了植物表达载体prbcS-121,通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法,将pBI121及prbcS-121转化烟草.对转基因烟草植株中GUS活性测定结果表明,烟草rbcS启动子具有叶部组织特异性,且在叶部启动基凶表达能力较CaMV35S启动能力强,从而为外源基因在转基因烟草叶片中的高效表达提供了新的工具,为后续目的基因能在烟草叶部发生组织特异性和光诱导性表达奠定了基础.     

菜热休克蛋白基因HSP81.1启动子的克隆与功能验证

本研究从甘蓝型油菜（Brassica napus）基因组中扩增获得热休克蛋白基因启动子,并将其克隆至双元载体pBI121的GUS报告基因上游,构成双元表达载体pBI121 HSP GUS。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化烟草后获得转基因植株。对T1转基因植株研究表明,外源基因在42℃处理1h后开始表达,且即使用同样条件诱导,GUS基因的表达率和表达量在不同生长时期也有差异。在第50d左右的苗期,GUS基因的表达率和表达量高,但随植株老化而逐渐下降。研究显示,利用油菜的热休克蛋白启动子可以达到通过温度控制烟草基因表达的目的。     

TaERFL1基因过表达提高转基因烟草耐盐性

将转录因子ERFⅣ家族基因TaERFL1构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草新华1号.以转TaERFL1基因烟草为材料,研究ERF因对烟草耐盐性的影响,并测定盐胁迫下转基因烟草的叶绿素含量.结果显示,在高盐胁迫下,TaERFL1基因的过表达促进了转基因烟草...     

转TaW基因提高烟草的耐盐性

TaW基因是从小麦的cDNA文库中克隆获得的ERF类转录因子,含有一个AP2/ERF保守域。将TaW基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38。以转TaW基因烟草为材料,研究TaW基因对烟草耐盐性的影响,测定盐胁迫下转基因烟草离体叶片的叶绿素含量,并观察转基因烟草T2代植株在盐胁迫培养基上的生长情况。结果显示,转基因烟草叶片的叶绿素含量明显高于对照,转基因烟草在盐胁迫培养基上的生长情况明显好于野生型植株,从而说明TaW基因的过表达提高了烟草的耐盐性,为烟草抗逆性育种的分子改良提供了依据。     

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。      

细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。     

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定,再用Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式PCR(Semi-nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因;利用限制性内切酶Hind Ⅲ对半嵌套式PCR产物进行酶切,从而验证半嵌套式PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明,半嵌套式PCR是一种快速、灵敏的检测转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的方法。      

利用冷诱导表达ICE1载体提高烟草抗寒性

利用拟南芥克隆转录激活因子ICE1和RD29A启动子,将ICE1连上RD29A启动子,构建成冷诱导植物表达载体pBin-RD29ICE1,通过农杆菌介导法转化烟草,获得了99棵抗性转基因再生烟草植株。通过PCR鉴定44%为阳性,将PCR检测到的44棵阳性植株进行Southern杂交检测,80%为阳性。转基因与野生型烟草同时经受低温处理,前者抗寒性明显提高。     

拟南芥花期基因转化烟草及其早花反应特性研究

为探讨花期基因对烟草开花早晚的影响及其在加快育种进程中的利用价值,采用RT-PCR方法从拟南芥克隆获得花期基因(FT),经过测序分析、酶切鉴定后连接到植物表达载体P22上,构建植物重组载体P22-FT。通过农杆菌介导,将FT基因转入烤烟品种Coker 371 gold后获得了26株阳性植株。研究结果表明,FT基因对烤烟品种Coker 371 gold的外观形态和花期具有较大的影响;与未转基因对照比较,FT阳性植株平均叶片数少15~16片,平均株高矮80 cm,现蕾时间提前了75 d左右。通过阳性植株自交分离群体及阳性植株与对照植株的杂交分离群体的鉴定选择,获得了单拷贝FT基因的2个阳性植株。早花基因转化烟草可以有效诱导烟草早花,缩短烟草生育期一半时间,单拷贝可分离早花植株在加快烟草育种进程中具有重要利用价值。     

烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。