枯草芽孢杆菌SH7 抑菌蛋白产生的最佳发酵条件及温室防效

枯草芽孢杆菌SH7可抑制烟草青枯病菌的生长,利用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取抑菌蛋白质,测定其对烟草青 枯病菌抑菌活性,从而确定抑菌蛋白产生的最佳培养基和培养条件。本实验产生抗菌蛋白的最佳培养基为NA液体培养基, 最佳发酵条件为：pH 6.0,26 ℃,装液量100 mL,170 r/min振荡培养96 h。粗抑菌蛋白在pH为9.0和10.0时,其抑菌活性仍 保持为86%, 88%,对碱稳定;在100 ℃和121 ℃处理20 min,其抑菌活性仍保持为83.1%, 68.0%,具有良好的热稳定性。在 温室内,抗菌蛋白粗提液对烟草青枯病可取得70.8%的防效。     

巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium，Bm）的抑菌活性及定殖规律分析

为进一步明确巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium,Bm）菌株对烟草主要病害的抑制效果,利用半叶法、对峙平板法和抑菌圈法研究了Bm对烟草花叶病毒（TMV）、黑胫病菌和青枯病菌的抑制作用;利用抗生素诱导筛选抗药性标记菌株,研究其在烟草根际土壤和叶面上的定殖规律;同时制备了生防菌发酵液制剂,测定其田间防治效果。结果表明:Bm发酵液和发酵上清液对烟草花叶病毒的抑制率分别为88.4%和74.3%;Bm无菌发酵上清液对黑胫病菌菌丝生长的抑制率为67.5%,对青枯病菌的抑菌圈直径为10.03 mm。抗药性菌株Bm-rif生长性状与野生型无差异。室内定殖试验结果显示,Bm-rif稳定定殖菌量在非灭菌土壤中为0.04×105 cfu/g,在灭菌土壤中为0.47×105 cfu/g,均显著高于叶面定殖菌量;接种TMV-GFP前24 h叶面喷施发酵液对TMV初侵染的抑制率为44.04%。菌株发酵液稀释后喷淋烟株茎基部,对烟草黑胫病和青枯病的田间防治效果分别为68.09%和51.02%。因此,Bm具有抑菌活性且能在烟草根际土壤中有效定殖,具有开发为生防菌剂的潜力。      

烟草青枯病颉颃细菌的筛选及其防病效果研究

从安徽、浙江等地的烟草、蕃茄和辣椒等茄科作物根标、根围土壤和病、健植株组织中,分离纯化到168个细菌菌株,通过室内异步培养法和平板扩散法,筛选出17个对烟草青枯病菌具有一定颉颃作用的菌株,其中,AQB-46和AQB-33两菌株抑菌能力最强,抑菌圈直径分别为33.7mm和30.6mm。盆栽防病结果表明,这2个菌株对青枯病的防治效果在接种青枯菌后的30d内一直维持在54.2%~64.7%。菌株AQB-62室内抑菌试验效果明显低于AQB-46和AQB-33,但盆栽防病的效果在接种后的20d内也一直维持在49.9%~53.0%的水平。接种前3d喷施颉颃菌的各处理,其防病效果远高于接种后3d喷施颉颃菌的各处理,前者防效最高为64.7%,而后者最高仅为15.0%,说明颉颃菌对烟草青枯病的防治主要表现为预防。此外,颉颃菌的防病作用主要表现为减轻发病程度,而对发病率没有影响。颉颃菌除具有直接的抑制青枯菌定殖、繁衍、扩展外,有的菌株如AQB-62还具有一定的诱导抗性作用。AQB-46,AQB-33和AQB-62等3个菌株可望研制成生物农药,使之更有效地防治烟草青枯病。      

抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传细菌性烟草病害,主要危害烟草的根茎,严重影响烟草的产量。从青枯病发病田健康烟株分离内生细菌55个,通过平板拮抗实验筛选,R-3、R-7、R-9菌株对青枯雷尔氏菌有明显的拮抗作用。gyr B基因序列分析表明,R-3、R-7、R-9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。3个菌株的发酵液经115℃高温处理均能保持对青枯雷尔氏菌的抑制活性,说明3株贝莱斯芽胞杆菌可产生耐高温的抑菌物质。田间试验结果表明,R-3、R-7和R-9均可长期定殖于烟草根和茎中,对青枯病的防治效果分别为55.72%、48.34%和50.71%。     

人参根腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

目的：从人参根际土壤中筛选出拮抗人参根腐病的菌株,初步研究其抑菌作用。方法：采用平板稀释法从人参根际土壤中分离获得菌株,以人参根腐病菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定;检测拮抗菌无菌发酵液对根腐病菌菌丝生长、孢子萌发的影响,同时测定拮抗菌的抑菌谱。结果：分离获得一株对人参根腐病原菌拮抗作用较强的菌株HB-3,经鉴定菌株HB-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株无菌发酵液对人参根腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用;菌株HB-3的抑菌谱较广,对根腐病菌、疫霉病菌、锈腐病菌、菌核病菌、灰霉病菌均有一定的抑菌活性。结论：筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌HB-3,能显著抑制人参根腐病菌的生长,对人参根腐病有较强的生物防治效果。     

罗伊氏乳杆菌NCU801的鉴定及抑菌性能研究

从乳猪粪便中筛选出1株乳酸菌,经生理生化和分子生物学鉴定,该菌株为罗伊氏乳杆菌,命名为罗伊氏乳杆菌NCU801。采用牛津杯法,分别对其发酵液、发酵液的无菌上清液、发酵液的菌体进行体外抑菌性能研究。结果表明,NCU801发酵液对大肠埃希氏菌CMCC444的抑制作用最强。进一步研究无菌上清液经热处理、p H调节、氯仿和酶处理后对大肠埃希氏菌CMCC444的抑菌活性的影响,考察无菌上清液对大肠埃希氏菌生长的影响。结果显示,温度、酶对无菌上清液的抑菌效果无显著影响;p H接近中性时,抑菌效果减弱;氯仿抽提后显示,无菌上清液中的抑菌物质全部是水溶性物质;且无菌上清液能显著性的影响大肠埃希氏菌的生长。     

烟草灰霉病复合生防细菌的筛选

采用平板对峙法和孢子萌发法,测定470株烟草内生细菌对烟草灰霉病菌的抑菌活性,初筛出抑菌作用较强的27株菌株;利用烟叶组织法进行复筛,获得防治效果超过50%的12株菌株,属于芽孢杆菌属或假单胞菌属;测试了7株生防菌之间的亲和性,除菌株Y98外,其他菌株之间均表现亲和;根据菌株亲和性及生防效果,选择5株生防菌株进行混配,测定其对烟草灰霉病的防治效果,发现芽孢杆菌菌株Y11与假单胞菌菌株Y141在其比例为2:1时的防效较好,且高于单菌株处理。      

放线菌F8对烟草黑胫病的拮抗作用及其产酶活性

从山东五莲于里黑胫病烟田健康烟株根际土壤分离到一株拮抗放线菌,编号为F8.为了科学评价该菌株在烟草黑胫病生防中的应用潜力,测定了其抑菌活性、产酶活性及控病效果,并通过形态学及16S rDNA序列分析研究其分类地位.结果表明,该菌株对于供试的烟草黑胫病菌具有较强的抑制作用,经无菌滤液处理后的菌丝生长畸形且停滞;该菌株具有几丁质酶、纤维素酶及蛋白酶活性.温室盆栽试验的防治效果显示接种后30 d,F8发酵液对烟草黑胫病的防效为70.3%;根据菌株形态特征、培养特性、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为链霉菌属不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes subsp. streptozoticus).     

青枯雷尔氏菌拮抗放线菌的筛选及其抗菌活性物质的分离

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的土传性病害。从健康土壤中分离到对青枯雷尔氏菌具有明显拮抗作用的放线菌LC-7,经初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)。链霉菌LC-7的发酵液用氯仿、正丁醇萃取后,通过捷克八溶剂系统分析,判定该抗菌物质为碱性水溶性抗生素。抗菌物质进一步采用离子交换树脂纯化,并经醇沉后,获得抗生素的结晶,再用HPLC进一步纯化后并进行质谱分析可得出,LC-7所产抗菌活性物质为一种新的氨基糖苷类抗生素,其分子量为365.1。田间试验表明,链霉菌LC-7对烟草青枯病具有显著的防治效果,防效为85.48%。     

不同真菌菌剂对烟草病毒病的田间防治效果

真菌激发子能诱导植物产生系统抗性,表现出抗植物病毒的作用。对西瓜枯萎菌、苹果轮纹菌、小麦赤霉,以及土壤真菌ESF-6菌株、XFPF-6菌株、C1菌株、XFSF-8菌株、疫霉等8种真菌菌剂的抗病毒活性进行了研究。用不同真菌发酵液喷雾处理田间烟草植株叶片,检测真菌菌剂对烟草病毒病的防治效果。结果表明,8种真菌菌剂对烟草病毒病均有一定的防治效果,其中ESF-6菌剂防效最高,发病高峰期的防效为83.8%。在烟草整个生长期真菌XFPF-6的防效较为稳定,防效稳定在60%以上。小麦赤霉菌,苹果轮纹菌的防效也较高,分别为64.8%,73.7%。除C1菌剂外,其他7种真菌菌剂的防效均高于盐酸吗啉胍,可开发为真菌抗病毒菌剂。经18s rRNA序列测定和显微形态观察鉴定ESF-6为曲霉(Aspergillus sp.),XFSF-8为青霉(Penicillium sp.)。     

无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

为进一步揭示无致病力菌株对烟草青枯病的控病机理,以无致病力青枯菌株为材料,针对烟草青枯病进行了温室控病及田间小区试验,并通过抗药性标记测定其抗药性突变菌株在烟株体内的定殖状况,同时分析处理后烟株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果显示:无致病力菌株Tbw1-7-3在温室盆栽条件下对青枯病的相对防效达89.4%,其田间防效在发病初期10~20 d与药剂农用链霉素处理间无明显差异,且其抗药性突变株在烟株根表和体内可短暂定殖。同时菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3种酶活性及促进病程相关蛋白(PRP)的积累。无致病力菌株对烟草青枯病具有较好的控制作用,以菌株Tbw1-7-3的防效最优。田间试验也显示Tbw1-7-3菌株在发病初期具有良好的控病效果。无致病力青枯菌株的控病机理可能兼有占位效应及诱导抗病性。      

枯草芽孢杆菌SH7 抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用

采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析、Sephadex G-75 凝胶层析及聚丙烯凝胶电泳,从 枯草芽孢杆菌SH7 代谢物中分离纯化出一种相对分子质量为33.6 kD 的蛋白,该活性物质具有淀粉酶活力,对烟草青枯病菌 具有一定的抑制作用。     

生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用

  目的  探究不同用量的生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用  方法  采用稀释平板法,研究生物炭对青枯菌的吸附作用及对其生长和运动性的影响;盆栽试验研究生物炭对烟草生长及青枯病发病情况和土壤基本理化性质的影响;利用高通量测序技术,比较各处理土壤细菌群落差异。  结果  （1）生物炭对青枯菌具有抑制作用,可吸附青枯菌、抑制其生长及运动性,用量超过1.5%时效果显著;（2）生物炭提高了土壤pH、有机质、速效磷和速效钾含量,利于烟草的生长。相关性分析发现,生物炭对土壤pH和化学性质的改善,是抑制烟草青枯病发生的主要原因;（3）生物炭提高了根际土壤微生物群落的Alpha多样性和放线菌门中链霉菌属的相对丰度;（4）根际土壤细菌结构的多样性与土壤理化性质有一定的相关性,其中有效钾影响最大。  结论  生物炭通过对青枯菌的抑制作用和对土壤微生态的改善,创造了利于烟草生长的环境条件,减少了烟草青枯病的发生。      

云南保山烟草青枯病的病原鉴定及发生规律

通过对保山烤烟大田烟株茎下部出现黑色坏死症状进行调查、鉴定,发现其主要原因为烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum E.F Smith)侵染。本文分析了该病发生流行与烤烟品种、土壤环境、气候条件及栽培管理等因素的密切关系,提出了农业综合防治烟草青枯病的措施。     

豫南烟区烟草青枯病菌的致病力及遗传多样性分析

为有效防控豫南烟区烟草青枯病,对来自信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县的烟草青枯病菌的致病力和遗传多样性进行了测定分析。人工接种试验表明,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力分为强、中和弱3种,不同寄主来源的烟草青枯病菌具有显著的致病力差异。从100个随机引物中筛选出8个扩增条带清晰且具有丰富多态性的引物用于不同地区烟草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析,共扩增出720条带,其中多态性带占88.9%。聚类结果和遗传相似系数分析显示,供试菌株可分为A、B两大类,遗传相似系数范围为0.49~1.00,且供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。综上所述,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力存在明显差异且其DNA具有丰富的遗传多样性。     

烟草青枯病拮抗菌的筛选及抑菌活性的测定

为有效防治烟草青枯病,从贵州省青枯病迟发烟地和不发烟地土壤中筛选出15株拮抗菌,对拮抗菌的拮抗能力进行了鉴定。筛选出拮抗力较强的3个菌株(LCA-9、PCM-4、SXM-2),并对3菌株的抗菌物质进行了粗提,检验其抑菌活性。结果表明:3种菌的发酵分泌液对烟草青枯病均有一定的抑制作用,其中SXM-2发酵液的抑菌活性较大、效果较好。     

烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究

由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是制约我国烟草产业发展的瓶颈之一。选育抗病品种是防控该病最经济有效的策略。为探寻快速评价烟草品种青枯病抗性的方法,以6个抗感水平差异显著的烟草品种试管苗为研究对象,采用浸根接种法,评价了室内快速鉴定方法的可行性。结果显示,以浓度为3×10⁶ cfu/mL的青枯菌体悬液接种21 d后,红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8,各品种试管苗的病情指数与田间自然发病情况呈明显正相关性,相关系数为0.936,达极显著水平。由此可见,室内无菌苗接种法能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平,可作为快速、可靠评价烟草品种抗性水平的初筛手段。     

烟草青枯菌遗传多样性分析

【目的】阐明中国主要产烟省区烟草青枯菌的种内遗传多样性,揭示烟草青枯菌种内遗传多样性与烟草品种、地理来源等的关系,为指导烟草青枯病抗病育种及综合防治等提供理论依据。【方法】采用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）研究方法对采自我国11个主要产烟省区的93株烟草青枯菌进行种内遗传多样性分析。【结果】93株供试菌株被分为51个序列型（Sequence Type, ST）,运用eBURST V3软件共享5/7基因标准可将所有供试菌株划分为4个亚群(group)与4个单一群（singleton）。【结论】实验结果表明,我国烟草青枯菌地理分布广泛,存在丰富的种内遗传多样性,但烟草青枯菌的组群划分与菌株的地理区域和烟草品种没有明显的相关性。