人肠道病毒71型VP4多抗的制备及其应用

目的制备人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP4多抗,并鉴定EV71空心颗粒(empty particle,EP)和实心颗粒(full particle,FP)。方法构建重组表达质粒p GEX-6p-1-VP4,诱导表达并纯化GST-VP4融合蛋白,免疫家兔制备多抗。ELISA法检测抗体效价,免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法鉴定抗体特异性。应用制备的多抗经Western blot法区分EV71 EP与FP。结果质粒p GEX-6p-1-VP4经双酶切及测序鉴定证明构建正确,纯化后的GST-VP4融合蛋白相对分子质量约32 000,以包涵体形式存在。免疫家兔后可获得效价达10~(10)的多抗。兔抗EV71 VP4多抗可识别EV71原核表达及天然病毒颗粒中的VP0、VP4。结论抗EV71 VP4多抗可应用于EV71 EP及FP的鉴定,为EV71的基础研究及疫苗研发提供了新的工具及方法。     

肠道病毒71型收获液蛋白成分的分析

目的分析肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)收获液中的蛋白成分,为该类疫苗的研发及质控提供参考。方法将EV71安徽阜阳株接种于Vero细胞,病毒培养72 h后,收获病毒液,经蔗糖密度梯度超滤离心、甲醛灭活、DEAE Sephorase FF介质离子交换层析纯化,获得纯化样品。应用透射电镜分析样品中病毒颗粒的形态;对非还原型SDS-PAGE检测疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N-末端氨基酸序列分析;液相色谱(liquid chromatography,LC)与电喷雾电离质谱(electrospray ionization,ESI-MS)结合的方法分析样品中所含的蛋白成分。结果纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20³0 nm的球形EV71颗粒,呈典型的肠道病毒形态;经SDS-PAGE分析,第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符,N-末端氨基酸序列与GenBank报道的安徽阜阳株序列(ACD63039.1)一致;LC/ESI-MS质谱分析显示,纯化EV71样品中病毒蛋白成分占绝对优势,包括EV71的蛋白多聚体、VP1、VP2、VP3、VP4蛋白。结论对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行了初步分析,为该类疫苗的研发及质控提供了参考。     

乙型肝炎病毒X蛋白对小鼠胚胎肝干细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X蛋白(HBx)对小鼠胚胎肝干细胞(embryonic liver stemcell,ELSC)凋亡及相关蛋白Bcl2、Mcl1、Bax表达的影响。方法采用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒载体系统将HBx基因转入小鼠胚胎肝干细胞ELSC14.5中,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中HBx基因mRNA的转录和蛋白的表达;Hoechst33342染色法观察细胞核的改变;TUNEL法和流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Real-time PCR和Western blot法检测抗凋亡因子Bcl2、Mcl1和促凋亡因子Bax基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果重组腺病毒Ad-GFP-HBx能有效感染ELSC14.5细胞,HBx基因和蛋白均能特异性表达;感染的ELSC14.5细胞核呈现固缩,且边缘化的细胞数减少,细胞凋亡率降低;细胞中Bcl2和Mcl1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均增高,而Bax的表达降低。结论 HBx可通过调节Bcl2家族中抗凋亡因子和促凋亡因子的比例失衡,来抑制小鼠胚胎肝干细胞的凋亡,促进其存活。     

禽流感病毒NS1A蛋白诱导人肺癌细胞SPC-A1的凋亡

目的研究禽流感病毒NS1A蛋白对人肺癌细胞SPC-A1增殖的影响。方法将含有NS1A基因的重组质粒pVAX1-NS1A经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,用MTT检测其对细胞增殖的抑制作用;Annexin VFITC-PI结合流式细胞仪检测细胞凋亡率;PI结合流式细胞仪检测细胞周期的变化;对转染细胞的表达产物进行Western blot分析。结果NS1A蛋白能抑制人肺癌细胞SPC-A1增殖且呈时间依赖性。随着作用时间延长,重组质粒转染组细胞凋亡率可达38.17%,细胞周期中G0/G1比例升高,G1期阻滞。Western blot分析显示,重组质粒转染组细胞在相对分子质量约30000处可见特异性反应条带,与NS1A蛋白产物大小相符。结论禽流感病毒NS1A蛋白能够抑制SPC-A1细胞增殖,并诱导SPC-A1细胞凋亡。     

靶向肠道病毒71型VP1基因的siRNA表达质粒的构建

目的构建靶向肠道病毒71型(EV71)VP1基因的siRNA表达质粒,并进行鉴定。方法构建靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3;脂质体法转染A549细胞株,筛选阳性克隆,通过荧光定量PCR和Western blot,分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定EV71VP1基因的表达。结果质粒pSVSi1、pSVSi2和pSVSi3经测序证明构建正确。pSVSi1对A549细胞VP1基因的抑制效果最好,在mRNA和蛋白水平上的抑制率分别为87%和89%,pSVSi2和pSVSi3在mR-NA水平上的抑制率分别为60%和70%。结论已成功构建了靶向EV71VP1基因的siRNA表达质粒,并筛选出一种对VP1基因有显著抑制作用的siRNA,为手足口病的siRNA基因治疗奠定了基础。     

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白在人支气管上皮细胞中对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响

目的探讨肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsakievirus A 16,CA16)VP1蛋白在人支气管上皮细胞中对天然免疫相关信号分子的表达及T细胞免疫反应的影响。方法经RT-PCR法扩增EV71和CA16的VP1序列,插入至载体pcDNA3. 1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA-EV71-VP1和pcDNA-CA16-VP1。分别转染人支气管上皮细胞16HBE,于转染后24、48和72 h收集样本,进行细胞内天然免疫相关信号分子表达的检测和刺激T细胞增殖的检测。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒pcDNA-EV71-VP1和pcDNA-CA16-VP1构建正确。与阴性对照组比较,EV71-VP1组IFNγ、OX40L、RANKL、TNF-α和IL-2的水平上调,而CA16-VP1组的上调幅度较小。EV71-VP1及CA16-VP1组16HBE细胞的胞内外提取物均可明显刺激分泌IFNγ的T细胞增殖(P 0. 05)。结论 EV71和CA16 VP1蛋白在人上皮细胞16HBE中表达后,可差异性诱导细胞中天然免疫信号分子表达及相似的非特异性刺激T细胞增殖能力。     

重组腺病毒介导的FOXO/MDA-7对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨重组腺病毒介导的FOXO/MDA-7对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制。方法将MDA-MB-231细胞分为Ad-FOXO/MDA-7组、Ad-FOXO组、Ad-MDA-7组和空白对照组,采用Real-time PCR、q RTPCR和Western blot法检测各组细胞中FOXO和MDA-7基因的转录及蛋白表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Transwell法检测细胞的侵袭能力;Western blot法检测细胞中Ras、Raf、MEK和ERK蛋白的表达情况。结果与其他各组相比,转染Ad-FOXO/MDA-7后,MDA-MB-231细胞中FOXO和MDA-7的表达明显增强,细胞的增殖活力和侵袭能力明显被抑制(P0.05),凋亡率明显升高,细胞中Ras、Raf、MEK和ERK蛋白的表达也明显被抑制。结论重组腺病毒Ad-FOXO/MDA-7能明显促进乳腺癌细胞的凋亡,为乳腺癌的基因治疗提供了新的思路。     

新城疫病毒F基因与传染性法氏囊病毒VP0基因在鸡痘病毒中共表达

目的 新城疫病毒（NDV）F基因和传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP0基因在鸡痘病毒中表达,以便研制新城疫和传染性法氏囊多价重组疫苗。方法 利用鸡痘病毒282E4株非必需区TK基因构建的表达载体PU-TA2,在已存在的复合启动子p7.5ATI下游同向插入F基因,反向插入复合启动子P7.5ATI,并在其下游反向插入VP0基因,构建由2个相同的复合启动子在相反方向分别表达F和VP0蛋白的PATI2-F-VP0表达载体。使其与鸡痘病毒282E4株共转染CEF细胞后,用BUDR法筛选重组病毒,通过间接免疫荧光法检测阳性重组病毒。用Western blot法检测F和VP0蛋白。结果 在重组病毒株中,用Western blot法可检测到F和VP0蛋白。结论 已成功地获得可同时表达F蛋白和VP0蛋白的重组鸡痘病毒。     

miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响

目的探讨miRNA-155对人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1表达及其增殖的影响。方法采用LipofectamineTM2000将miRNA-155 mimics(或带荧光无关序列阴性对照FAM-NC)转染雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性人乳腺癌MCF-7细胞,并设空白对照组;RT-PCR法检测转染后miRNA-155的表达水平;CCK-8法检测miRNA-155对MCF-7细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡率和增殖周期;Western blot法检测TP53INP1、Caspase-3及p21蛋白的表达水平。结果与空白对照组和阴性对照组相比,转染组miRNA-155的表达量明显增高;随着时间的延长,MCF-7细胞增殖活力逐渐增加;G1期细胞明显减少,S和G2期细胞增多,凋亡率明显降低;TP53INP1、Caspase-3激活型及p21蛋白的表达水平均明显降低。结论 miRNA-155能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞TP53INP1蛋白的表达,进而抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖,在乳腺癌发生发展中具有重要作用。     

肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因。非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制。2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关。一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染。本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述。     

肠道病毒71型Lanzhou01株的分离及其生物学特性

目的对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)Lanzhou01株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为EV71疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法从兰州市手足口病患者的粪便样本中分离EV71,经蚀斑克隆传代后,RT-PCR法检测其特异性;Vero细胞甲基纤维素蚀斑法分析病毒的毒力;克隆病毒的VP1基因,进行序列测定及分析;扫描电镜观察病毒的形态;以不同的MOI接种Vero细胞,观察细胞病变,并绘制病毒的增殖曲线;连续传代,分析VP1基因和氨基酸序列,并测定毒力,检测其遗传稳定性。结果经细胞传代和蚀斑克隆,获得增殖性能稳定的分离株,RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约250bp的特异性条带;经VP1基因测序与进化树鉴定为EV71,其与浙江、深圳等地的EV71分离株的核苷酸序列同源性均大于99%,属于C4基因亚型;电镜下观察病毒颗粒为球形,直径20～30nm;该病毒在Vero细胞上培养后产生典型的细胞病变,毒力为6.8LgPFU/ml;经Vero细胞连续传30代,不同代次的病毒VP1基因序列的核苷酸序列同源性大于或等于99.6%,氨基酸序列几乎没有明显变异,毒力也无明显改变。结论已成功分离1株EV71,其生物学特性良好,为灭活疫苗的研制及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

肠道病毒71型鼠源性中和单克隆抗体的制备

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blot法鉴定Protein A纯化的抗体;通过体外和体内中和试验鉴定抗体的中和特性。结果得到3株针对EV71 VP1的高效结合性单克隆抗体15H7、15G7和6G2,且15H7经中和试验证明具有较强的中和活性。结论成功制备了EV71鼠源性中和单克隆抗体,其在小鼠体内能成功地抑制病毒增殖。     

siRNA干扰C-C趋化因子配体5对喉癌细胞生物学特性的影响

目的 研究C-C趋化因子配体5(C-C chemokine ligand 5,CCL5)在头颈鳞状细胞癌中的表达，并探讨CCL5对喉癌细胞生物学特性的影响。方法 基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库查找CCL5在头颈鳞状细胞癌中的表达情况。将喉癌细胞TU177转染siRNA(siRNA组)，并设对照（NC）组，CCK8法、细胞划痕试验、流式细胞术分别检测各组细胞增殖、迁移、细胞周期及细胞凋亡情况；RT-PCR、Western blot法检测CCL5敲降效率及多药耐药蛋白2(multidrug resistance protein 2,MRP2)、bcl-2相关x蛋白（bcl-2-associated x protein,Bax）mRNA转录及蛋白表达水平。结果 CCL5在头颈鳞状细胞癌的表达高于正常组织（P <0.05）。与NC组相比，siRNA组siRNA具有较高的敲降效率（t分别为12.898和22.656,P均<0.01）;siRNA敲降CCL5可抑制喉癌细胞增殖、迁移...     

柯萨奇病毒A6型多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗柯萨奇病毒A6型(Coxsackie virus A6,CVA6)多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法将杆状病毒-昆虫细胞表达系统中共表达的CVA6病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯化后免疫日本大耳白兔,制备其多克隆抗体;用CVA6-R69-XY-2016、CVA10-R97-XY-2016、CVA16-V217-XY-2016、EV71-V54-XY-2016及CVA6 Gdula毒株分别感染人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞,体外中和试验及ELISA法检测中和抗体和结合抗体效价,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测抗体特异性。结果制备的兔抗CVA6 VLP多克隆抗体与CVA6-R69-XY-2016及CVA6 Gdula毒株的中和抗体效价均可达1 024,多克隆抗体仅与这2种病毒的结构蛋白VP1、VP2及VP3产生特异性反应,仅在这2种病毒感染的RD细胞中产生明显的绿色荧光;经ELISA分析,其结合效价达1×10~7。结论成功制备了兔抗CVA6 VLP多克隆抗体,其特异性良好,可为CVA6血清型中和试验鉴别、病毒结构蛋白定性定量分析提供抗体试剂。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8对宫颈癌HeLa细胞的作用及其相关机制

目的通过shRNA干扰宫颈癌HeLa细胞中肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor alpha induced protein 8,TNFAIP8,TIPE)的表达,分析TIPE对宫颈癌生存的影响。方法转染pCDH-shRNA-TIPE质粒至HeLa细胞株(TIPE干扰组),同时设未转染质粒的空白对照组及空载体转染的阴性对照组,qPCR和Western blot法检测TIPE的表达;加入能诱导细胞凋亡的抗人死亡受体5单链抗体(aDR5ScFv)后,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测TIPE、激活型caspase-3、激活型caspase-8和激活型caspase-9蛋白表达。结果与空白对照组相比,TIPE干扰组细胞mRNA和蛋白表达均显著降低(P 0. 05);加入aDR5ScFv后,TIPE干扰组细胞增殖抑制率和凋亡率与空白对照组和阴性对照组相比显著升高(P 0. 05)。TIPE干扰组细胞激活型caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白的表达显著高于空白对照组和阴性对照组(P 0. 05)。结论 HeLa细胞干扰TIPE表达产生显著调节作用,TIPE的表达降低可对caspase诱导的HeLa细胞凋亡途径产生抑制,对生物治疗新药的进一步研发具有重要意义。     

FOXC1蛋白基因shRNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的探讨FOXC1蛋白基因RNA干扰质粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法采用RT-PCR及Westernblot法检测SGC-7901细胞和胃黏膜上皮细胞GES-1中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。构建3个FOXC1基因shRNA真核表达质粒pshRNA-FOXC1a、pshRNA-FOXC1b、pshRNA-FOXC1c,分别转染SGC-7901细胞,并设pGenesil-1空质粒转染组和未转染的细胞对照组,RT-PCR及Western blot法分别检测转染细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;MTT法检测转染细胞的增殖活力;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期。结果 SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均显著高于GES-1细胞(P<0.05)。pshRNA-FOXC1a组、pshRNA-FOXC1b组和pshRNA-FOXC1c组SGC-7901细胞中FOXC1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均显著低于pGenesil-1组和SGC-7901组(P<0.01);细胞增殖抑制率显著高于pGensil-1组(P<0.05)。处于G1、G2期的细胞比例显著高于SGC-7901组(P<0.01),S期细胞比例显著低于SGC-7901组(P<0.01)。结论成功构建了FOXC1蛋白基因shRNA真核表达质粒。FOXC1在胃癌细胞SGC-7901中呈高表达,抑制其表达后,细胞周期被阻滞在G1～G2期,细胞增殖受到抑制。     

脑心肌炎病毒VP2基因真核表达质粒的构建

目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)VP2基因真核表达质粒,并于CHO细胞中表达。方法 RT-PCR法扩增EMCV VP2目的基因,克隆至载体pcDNA3. 1中,构建重组质粒pcDNA3. 1-VP2,脂质体法转染CHO细胞。转染48 h后,RT-PCR法检测EMCV VP2基因mRNA的转录情况,免疫组化法及Western blot法检测EMCV VP2蛋白的表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcDNA3. 1-VP2构建正确。EMCV VP2基因m RNA及蛋白可在CHO细胞中正常转录及表达,且EMCV VP2蛋白可与兔抗EMCV阳性血清发生特异性结合,主要分布于CHO细胞膜上。结论成功构建了重组质粒pcDNA3. 1-VP2,并有效地在CHO细胞中进行了表达,为EMCV VP2基因体外表达及其功能的进一步研究奠定了基础。     

肠道病毒71型类病毒颗粒在汉逊酵母中的表达及其免疫原性

目的于汉逊酵母中表达肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)类病毒颗粒(virus-like particle,VLP),并分析其免疫原性。方法将鉴定正确的重组质粒p MV-P1-3CD转化汉逊酵母AU0501,经筛选获得稳定整合P1和3CD基因的重组菌株p MV-P1-3CD/AU。30 L发酵罐培养重组菌株,发酵产物纯化后进行SDS-PAGE、Western blot、HPLC检测、电镜分析及动态光散射分析检测。采用不同方法制备EV71疫苗,分别免疫小鼠和家兔,检测动物血清中和抗体几何平均滴度(GMT),评价其免疫原性及不同佐剂对疫苗免疫原性的影响。结果重组菌株p MV-P1-3CD/AU表达产物及疫苗原液的SDS-PAGE分析显示,于相对分子质量26 000、33 000和35 000处均可见VP3、VP1和VP0蛋白条带,且相对分子质量33 000的蛋白可与EV71-VP1单克隆抗体发生特异性结合;疫苗原液的纯度达99%以上;电镜观察可见30 nm的VLP,颗粒均一度较好;小鼠血清GMT最高可达1 536,家兔血清GMT最高可达586,磷酸铝佐剂及氢氧化铝佐剂均可明显提高小鼠血清GMT。结论于汉逊酵母中成功实现EV71的P1和3CD基因的共表达,可形成EV71 VLP,且具有良好的免疫原性,为今后EV71 VLP疫苗的研制提供了实验依据。     

GINS2基因过表达对K562细胞增殖的影响

目的检测GINS2基因过表达对K562细胞增殖的影响。方法将Ad-GINS2感染K562细胞,扩增腺病毒,同时设空载体转染的空载组和未感染病毒的未处理组,PCR及Western blot法检测细胞中GINS2的转录及表达水平,MTT法检测细胞增殖水平。结果与空载组和未处理组相比,Ad-GINS2感染组细胞GINS2基因转录水平及蛋白表达水平显著升高(P0.05),Ad-GINS2能明显促进细胞增殖(P0.05)。结论 GINS2基因的重组腺病毒载体成功感染K562细胞并可促进K562细胞增殖,为进一步明确GINS2基因在白血病中的作用奠定了基础。     

紫菜多糖对肠道病毒71型乳鼠模型T细胞亚群及细胞因子的免疫干预作用

目的探讨紫菜多糖在肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)乳鼠模型中的免疫干预作用。方法取7日龄健康乳鼠40只,对30只经腹腔注射EV71国际标准株(VR-1432)200μL(约300 TCID50)/只,建立EV71感染模型,其中20只设为干预组,于建模24 h后用紫菜多糖灌胃,剂量为40 mg/(kg·d),其余10只为模型组,分别于接种病毒后第3和7天观察乳鼠的临床表现,并经眼球摘取采血,分离血清。同时设对照组(10只,未注射病毒)。流式细胞术检测T细胞亚群,ELISA法检测干扰素α(interferonα,IFNα)、肿瘤坏死因子-α(tumor ne-crosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及IL-10的表达水平。结果模型乳鼠经紫菜多糖干预后,显效5只,有效13只,无效1只,死亡1只。注射EV71后第7天,与模型组比较,干预组乳鼠的CD4~+及CD8~+T细胞比例明显升高(P<0.01),CD4~+/CD8~+比值明显降低(P<0.05);IL-6及TNF-α水平明显降低(P<0.001),IL-10及IFNα水平明显升高(P<0.001)。结论紫菜多糖在EV71乳鼠模型中,可诱导T细胞活化,促进IFNα等抗炎细胞因子的分泌,调节免疫功能,对EV71感染可起到正面免疫干预作用。