木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、p H5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kw PMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

重组α-1,3-葡萄糖苷酶的毕赤酵母表达及发酵优化

Acremonium sp. S4G13来源的α-葡萄糖苷酶基因连接到p PIC9K载体上并在Pichia pastoris GS115中表达。在此基础上对重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-AGL产重组α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了单因素优化试验,结果表明最优条件为:生长阶段接种量10%,甘油体积浓度3%,初始pH 6.0;诱导阶段甲醇初始添加量1%,甲醇补加量0.5%,装液量10%,诱导温度25°C,山梨醇添加量6 g/L。在最优条件下发酵120 h,酶活可达7.8 U/mL,相比优化前酶活1.22 U/mL提升了5.4倍。     

玉米谷氨酰胺酶基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定玉米谷氨酰胺转氨酶基因在毕赤酵母中的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPIC9K-TGZ经Sac I线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应扩增验证,甲醇诱导表达。通过正交试验确定工程菌最佳表达条件:表达培养基BMMY,诱导表达时间96 h,初始表达pH值6.0,菌体起始诱导OD600nm值4.0,诱导温度24 ℃,甲醇添加量0.6%(体积分数)、甲醇流加时间间隔12 h/次,诱导48 h后每24 h添加1 g/L甘油。采用优化的条件得到培养基上清的最高酶活达7.51 U/mL。     

耐热赖氨酸氨肽酶毕赤酵母表达及培养条件优化

为实现耐热耐氨酸氨肽酶的异源表达,通过PCR扩增技术从Pseudomonas aeruginosa NJ-814基因组中克隆获得耐热的赖氨肽酶基因(PLAP),构建重组载体p PIC9K-PLAP,并最终实现在毕赤酵母GS115中的分泌表达。对重组毕赤酵母进行初步筛选,单因素实验优化获得重组毕赤酵母最佳诱导条件如下:诱导培养基初始pH为5.0、甲醇质量浓度1.5 g/dL、诱导温度28℃、装液量25 mL/250 mL、Co~(2+)浓度50μmol/mL、山梨醇添加量9 g/L。在最优条件下,氨肽酶酶活提高了5.2倍,比酶活2.74 U/mg。实验结果表明:PLAP基因已成功转入毕赤酵母GS115并获得表达。     

重组角质酶的制备及合成乙酸乙酯条件优化

为了实现镰孢菌角质酶的高效表达,对重组菌株P. pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度28℃,初始诱导菌浓OD600为100,诱导阶段甲醇体积分数为1%条件下进行诱导产酶。在该条件下发酵138 h时上清酶活可达到最大值419 U/mL,是优化前的2倍。对重组角质酶在有机溶剂中合成乙酸乙酯的酯化条件进行了优化,结果表明,当底物乙酸浓度为0.1 mol/L,乙醇浓度为0.15 mol/L,温度50℃,在异辛烷中反应16 h,乙酸乙酯可以达到最大转化率94.12%。     

重组毕赤酵母生产凝乳酶发酵优化

为了获得毕赤酵母生产凝乳酶的最佳发酵条件,分别从起始诱导OD600、甲醇诱导浓度以及p H等方面研究了P.pastoris GS115在3.6 L发酵罐中表达微小根毛霉来源凝乳酶的高密度发酵,以恒溶氧反馈调节补加甘油和甲醇检测流加控制器在线监测流加甲醇。结果表明,在重组P.pastoris GS115/p PIC9k-chy起始诱导,OD600和甲醇诱导体积分数分别为150和2.0%,诱导p H为5.0时,发酵96 h凝乳酶活达到最大,为1 870 SU/m L,此时对应的生产强度和产物得率均达到最高水平,分别为19.48 SU/(m L·h)和2.42 SU/m L,总蛋白质质量浓度为0.64 mg/m L,凝乳活性与蛋白质水解活性的比值(MCA/PA)为63.43。     

共表达分子伴侣PDI和转录因子Aft1对毕赤酵母表达人溶菌酶的影响

通过共表达分子伴侣二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)和毕赤酵母转录因子Aft1,提高重组人溶菌酶(human lysozyme,HLY)在毕赤酵母中的分泌表达水平。将构建的分子伴侣表达载体pG418-PDI和毕赤酵母转录因子Aft1表达载体pG418-Aft1线性化后,电击转化重组毕赤酵母KM71-HLY细胞,用含G418的平板筛选阳性转化子,得到共表达分子伴侣PDI和HLY,及共表达毕赤酵母转录因子Aft1和HLY的工程菌株KM71-HLYpG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1。摇瓶发酵分析共表达PDI和Aft1对HLY表达水平的影响。结果表明,工程菌KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1经甲醇诱导均产生14.7 kDa HLY,发酵上清液在含溶壁微球菌平板上出现抑菌圈。在诱导表达前期,KM71-HLY-pG418-PDI、KM71-HLY-pG418-Aft1和KM71-HLY生长量无明显差别;70 h后,KM71-HLY-pG418-PDI菌株和KM71-HLY-pG418-Aft1菌株生物量少于KM71-HLY,发酵最终生长量分别为KM71-HLY的92.8%与84.1%。KM71-HLY、KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1经168 h甲醇诱导,胞外分泌总蛋白量分别为324.02、350.87 mg/L和474.8 mg/L,发酵液酶活力分别为34 880、45 600 U/mL和50 180 U/mL。与KM71-HLY相比,KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1发酵产胞外总蛋白分别增加了8.3%和46.5%;KM71-HLY-pG418-PDI和KM71-HLY-pG418-Aft1所产胞外溶菌酶总酶活力较KM71-HLY分别增加了30.7%和43.9%。     

毕赤酵母高效表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导方法研究

将甘草酸生物转化合成GAMG已成为国内外医药和食品行业研究的热点。该文在前期构建毕赤酵母(pichia pastoris)工程菌GS115-GUS的基础上,对重组毕赤酵母工程菌发酵条件进行了研究。通过单因素及正交试验建立工程菌最佳表达β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导产酶方法:重组毕赤酵母GS115-GUS菌株在液体YPD培养基中活化24 h后,接种到BMGY中富集菌体,OD600达到6.0时,按照1∶1(V/V)的接种比率接入到pH为6.0的BMMY培养基中,加入1.5%诱导剂甲醇诱导产酶,且每隔24 h添加一次。该诱导产酶条件简单、易行、科学、合理,毕赤酵母高效表达GAMG的酶活高达1.97×103 U/mL,研究结果达到预期目标,为进一步研究重组酵母工程菌产β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵水平、β-葡萄糖醛酸苷酶生物催化甘草酸制备GAMG以及工业化生产奠定基础。     

Bohai sea-9145重组脂肪酶基因工程菌的发酵表达条件优化

为提高大肠杆菌(E.coli)基因工程菌产Bohai sea-9145重组脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)的能力,有效制备Bohai sea-9145脂肪酶。采用单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面设计实验,对该重组酶基因工程菌的发酵表达条件进行了优化。最终确定的最佳条件是:接种量为1.5%,培养基的初始p H为8.0,诱导剂IPTG的添加时间为3.5 h,终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为15 h,诱导温度为16℃,摇床转速为200 r/min,经优化后该菌的产酶量是优化前的9.72倍。     

产耐高温Fe-SOD(H171A)重组大肠杆菌发酵条件的优化

超氧化物歧化酶因其在药物和化妆品等行业体现出重要应用价值,近年来为世人所关注。为了提高该酶的表达量,我们针对E.coli BL21(DE3)/p ET28a(+)-SOD重组表达系统,运用单因素实验及正交实验相结合的手段,确定了产耐高温Fe-SOD(H171A)重组大肠杆菌的最优培养基成分及最优诱导条件。实验结果表明,重组细菌在当向培养基中加入亮氨酸至终浓度为1.20g/L、氮源为30 g/L酵母粉并且调整碳氮比为1时,达到了最优诱导效果。另外当诱导条件为诱导剂浓度0.15 mmol/L,诱导温度37℃,诱导时间10 h时,重组菌达到了最优诱导效果。在优化条件下,菌体密度达到最高并且目的蛋白表达量为全菌体蛋白的52.90%,比基础培养基发酵条件高出0.68倍。     

一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母密码子偏好性对来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶基因进行优化并构建在细胞内表达普鲁兰酶的重组毕赤酵母。优化后普鲁兰酶编码基因Bd P4在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达水平平均比优化前的普鲁兰酶基因Bd P提高4倍以上。筛选到1株表达水平较高的重组菌Pichia pastoris GS115/p PIC9K-Bd P4 WB54。在5 L发酵罐获得了初步优化的发酵条件:发酵液p H 4.5,在菌体量达到87 g/L时开始甲醇流加,采用溶氧(DO)恒定策略控制甲醇流加,DO控制在25%的水平,甲醇流加速率为9.9 m L/(L·h),搅拌转速控制在最大值800 r/min,通风量2 V/(v·m)。在优化条件下重组菌发酵酶活在2 000 U/m L以上。重组酶最适p H为4.0,最适作用温度50℃,在50和55℃下酶活半衰期分别为32和18 h。     

β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达

为实现β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达,作者将经SalⅠ线性化的pPIC9K-xynⅡ电转化至工程菌GS115/Anman5A中,经G418浓度梯度筛选后获得能同时高产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的双重重组子GS115/Anman5A-xynⅡ。SDS-PAGE显示目的蛋白的相对分子质量分别约为52 000,24 100。摇瓶发酵筛选出产酶活性最强的转化株,命名为GSMX2,随后对该菌株的表达条件进行初步优化,优化后的表达条件为:诱导时间120 h,培养基起始pH值为7.0,甘油添加量为1.5%,甲醇添加量为1.5%。在此培养条件下,产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活性分别达到37.1 U/mL和193.6 U/mL。     

毕赤酵母工程菌表达猪β-干扰素

根据毕赤酵母密码子偏爱,人工合成了猪β-干扰素(PoIFN-β)基因,构建了重组载体pPICZA-PoIFN-β。重组载体经Sac I线性化后,电击转入毕赤酵母GS115,对在含博莱霉素(Zeocin)平板上生长的转化子进行鉴定,得到分泌表达猪β-干扰素的毕赤酵母基因工程菌株GS115/pPICZA-PoIFN-β。以1%甲醇诱导GS115/pPICZA-PoIFN-β表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,工程菌株实现了猪β-干扰素的高效分泌表达,表达产物为相对分子质量22ku和26ku的混合物,表达蛋白量约为80mg/L。     

人胰岛素B27K-DTrI前体在毕氏酵母中表达条件的优化

目的优化甲醇酵母表达系统,提高B27K-DTrI前体表达量。方法用不同浓度的G418 YPD平板、联合Real-time PCR筛选高拷贝菌株。优化高拷贝菌株的最佳起始诱导吸光度A、诱导时间、诱导剂浓度等表达条件。结果筛选到高拷贝菌株S3菌,最佳诱导条件为诱导起始A600约6.0,甲醇诱导浓度0.75%,诱导时间72 h,目的蛋白表达量118 mg/L。结论通过条件优化实验,为人胰岛素B27K的产业化提供了可靠的实验基础。     

人胰岛素B27K-DTrI前体在毕氏酵母中表达条件的优化

目的 优化甲醇酵母表达系统,提高B27K-DTrI前体表达量.方法 用不同浓度的G418 YPD平板、联合Real-time PCR筛选高拷贝菌株.优化高拷贝菌株的最佳起始诱导吸光度A、诱导时间、诱导剂浓度等表达条件.结果 筛选到高拷贝菌株S3菌,最佳诱导条件为诱导起始A600约6.0,甲醇诱导浓度0.75％,诱导时间72 h,目的蛋白表达量118 mg/L.结论 通过条件优化实验,为人胰岛素B27K的产业化提供了可靠的实验基础.     

蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达及其发酵条件优化

从赤子爱胜蚓体内克隆得到蚓激酶基因lks2,并成功在毕赤酵母GS115中表达,酶活为254. 4 U/mL。经摇瓶培养条件优化,确定最佳诱导条件为:初始OD_(600)=1. 5,pH 5. 5、温度28℃,此条件下诱导84 h,重组菌GS115-pPIC9K-lks2蚓激酶活峰值为397. 6 U/mL。利用10 L发酵罐进行放大培养,经优化确定最佳菌体接种浓度为9±0. 5 g/L,此条件下高密度发酵使前期培养时间缩短了11. 5 h,蚓激酶活力达到1 098. 2 U/mL,具有十分可观的工业应用潜力。     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶的发酵条件优化

以谷氨酰胺转氨酶生产菌株重组大肠杆菌BL21(DE3)/mtg为研究对象,对工程菌的发酵产酶条件进行了优化。首先通过单因素实验法,对培养基碳、氮源种类及浓度、培养温度、初始p H、装液量、接种量、诱导时机、诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行了优化;随后采用Plackett-Burman设计从中筛选出3个关键影响因子:初始p H、培养温度及诱导温度;最后通过Box-Benhnken设计建立上述3个因子对谷氨酰胺转氨酶比酶活的响应面模型。结果表明,最佳发酵条件为:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,培养温度34℃,初始p H7.0,装液量50 m L(250 m L三角瓶),接种量5%,诱导时机4 h,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间14 h。在该条件下,优化后的谷氨酰胺转氨酶比酶活达1.507 U/mg,为未优化前的1.56倍。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。