小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系.[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16(45)对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素(Taq聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验.[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系的影响为:Mg2+>Taq聚合酶>dNTPs>模板DNA>引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为:在20μl反应体系中,包括10×PCR Buffer 2.0μl、Mgt2+2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs 0.2 mmol/L、模板DNA 40 ng、引物0.6 μmol/L.[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础.     

SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化

[目的] 研究SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化.[方法]采用交互正交设计L27(313)对苦荞SRAP-PCR反应体系进行了5因素(Mg2+、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物)3水平优化筛选,比较了非变性和变性PAGE检测方法,并进行了DYCZ-24F与DYCZ-20C 2种电泳操作系统的对比试验.[结果]4个单因素(Mg2+、dNTP、Taq酶和引物)和2个交互作用(Mg2+×dNTP、Mg2+×Taq酶)对苦荞SRAP-PCR有极显著影响;最佳反应体系为:20 μl总体积,Mg2+ 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 40 ng,引物0.25 μmol/L,10×缓冲液 2 μl.运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,扩增条带清晰、多态性高、重复性好.将扩增产物进行非变性与变性PAGE和2种电泳操作系统检测,结果显示非变性PAGE、DYCZ-24F操作系统更适合于SRAP的分析.[结论]为今后构建苦荞SRAP遗传图谱奠定了基础.     

小麦-黑麦易位系的细胞学和SSR检测

[目的]对从小麦-黑麦代换系5R/5A与6R/6A杂交后代中选育的高代材料07-4进行鉴定.[方法]利用形态学、细胞学以及SSR标记技术进行综合分析.[结果]品系07-4农艺性状较好,有大穗、多小穗的优良特性;其根尖细胞染色体数目为2n=42,花粉母细胞减数分裂中期I(PMC MI)染色体构型为2n=21 Ⅱ.它与中国春小麦的杂种F1的PMC MI绝大多数细胞中形成21个二价体,且有四价体出现.SSR引物SCM268能在07-4品系中稳定地扩增出黑麦特异片段.[结论]综合形态学、细胞学和SSR分析结果初步确定,品系07-4是一个小麦-黑麦易位系.     

SSR技术鉴定玉米品种真实性反应体系的优化研究

[目的]优化SSR技术鉴定玉米品种真实性反应体系.[方法]对SSR技术参数(PCR反应体系、退火温度和电泳时间)进行了优化,并对辽宁省主推的10个玉米品种进行了鉴定.[结果]最优PCR反应体系为:灭菌超纯水14.60μl,10 × Buffer(Mg2+)2.00μl,dNTPs 1.20μl,Taq酶0.20μl,正、反向引物各0.50μl及DNA原液1.00μl.退火温度和电泳时间对PCR扩增结果的影响较大,所选的引物不同,在同一条件下呈现理想电泳条带所需的最佳退火温度和电泳时间不同.[结论]该体系应用于杂交玉米品种的真实性快速鉴定是可行的.     

华北落叶松AFLP反应体系的建立和优化

[目的]建立和优化华北落叶松(Larix principis-rupprechtii Mayr.)的AFLP反应体系.[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素(酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数)进行了研究.[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0 μl的前提下,酶切时间为7 h(37 ℃ 3.5 h;65 ℃ 3.5 h),EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0 μl(50 ng/μl),连接产物稀释10倍取5.0 μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0 μl用于选择性扩增.[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究.     

草莓角斑病菌PCR检测研究

[目的]研究草莓角斑病菌的快速检测方法.[方法]根据草莓角斑病菌的hrp基因,设计了1对引物XF-F/R,进行该病菌PCR特异性扩增.[结果]该引物可特异性地扩增草莓角斑病菌的DNA、菌悬液、人工接种样品.[结论]该检测方法特异性强、灵敏度高,可适用于草莓角斑病菌的检测.     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达栽体.[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入栽体pET-28a中.[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上.经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达栽体.[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体.     

地衣芽孢杆菌16S-ITS标记及其特异性分析

[目的]建立地衣芽孢杆菌的分子鉴定方法.[方法]通过对地衣芽孢杆菌TS-01的16S和ITS序列进行克隆测序和差异性分析,以该区序列为靶序列设计地衣芽孢杆菌TS-01的特异性引物,并用该引物扩增全部受试菌种.[结果]从ITS和16S rDNA区间设计了地衣芽孢杆菌种特异性引物,特异性引物PCR的最佳退火温度为67.2℃,循环数为24个;地衣芽孢杆菌TS-01可扩增出1条905 bp的标记片段,其他受试菌株均为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异16S-ITS标记.[结论]地衣芽孢杆菌TS-01分子鉴定方法的建立,为地衣芽孢杆菌的分子诊断奠定了基础.     

小麦NBS类序列的分离与特征分析

[目的]获得小麦近等基因系TcLr24中NBS类抗病基因同源序列.[方法]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构"P-loop"和"GLPL"合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增.[结果]得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物序列,包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构,相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.1%～98.3%,同时对分离的RGAs的氨基酸序列和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行聚类分析表明,与Xal、RPS2亲缘关系较近,而与Lr21亲缘关系较远.[结论]TcLr24中NBS类RGAs可能会有与Lr21不同机制的抗病功能.     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法.[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA.根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18S rDNA和5.8S rDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1(ITS-1),PCR产物直接测序.[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434 bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊 .[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础.