低剂量地西他滨联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用

目的 研究低剂量地西他滨(DAC)联合伊马替尼(IM)对K562细胞株的增殖抑制作用及对bcr-abl表达的影响.方法 单药及两药联合后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察药物对K562细胞株的增殖抑制作用,流式细胞术检测药物对K562细胞株早期凋亡率及细胞周期,巢式反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测药物对K562细胞株bcr-abl mRNA表达.结果 DAC与IM单药对K562细胞的抑制作用呈浓度时间依赖性.两药联合用药抑制作用较单药组明显(F=43.947、165.580、321.193、296.101,均P<0.05),24、48、72 h各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义(F=202.759、168.457、417.538,均P<0.05).DAC及IM单药作用药物对K562细胞株均使G,期细胞明显增多,IM0.2μmol/L作用于K562细胞株48 h可见6.7%早期凋亡细胞,IM 0.2 μmol/L联合DAC 4μmol/L早期凋亡细胞增加至8.4%.bcr-abl mRNA表达水平降低,DAC 4 μmol/L作用48 h后可降低K562细胞中bcr-abl mRNA表达(约14%),IM 0.2 μmol/L降低约40%,联合用药表达量明显降低(约60%).联合用药组与单药组比较差异有统计学意义(F=71.981,P<0.05).结论 DAC对K562细胞的增殖抑制作用与细胞周期阻滞、诱导凋亡及降低bcr-abl mRNA表达有关,两药联合可显著抑制K562细胞增殖.     

K562细胞硫氧还蛋白还原酶活力测定及其抑制剂体外抗白血病的初步研究

目的 探讨慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562中硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活力及其新型抑制剂乙烷硒啉(BBSKE)体外抗白血病作用.方法 应用胰岛素还原法检测K562细胞株及健康人骨髓单个核细胞中TrxR的活力.运用CCK-8法测定BBSKE对K562细胞的增殖抑制率.应用激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳以及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术观察BBSKE的抗白血病作用.结果 K562细胞中TrxR的活性明显高于健康人骨髓单个核细胞,10 μmol/L BBSKE与K562细胞作用24 h,激光共聚焦显微镜可见典型的细胞凋亡表现,琼脂糖凝胶电泳后可见典型的DNA"梯"条带出现,流式细胞术检测凋亡率为(10.28±2.74)%;10 μmol/LBBSKE对CML患者原代细胞有诱导凋亡的作用,凋亡率为(5.70±0.48)%.结论 慢性粒细胞白血病细胞株K562中TrxR活力高于健康人骨髓单个核细胞,BBSKE有抑制TrxR活力、抑制K562细胞增殖和诱导凋亡的作用,是治疗CML潜在的有效药物.     

地西他滨联合三氧化二砷对NB4细胞凋亡作用的研究

目的 研究去甲基化制剂地西他滨(DAC)单用或联合三氧化二砷(As2O3)对NB4细胞凋亡的作用机制.方法 将不同浓度的DAC、As2O3以及两药联合作用于NB4细胞,不加药为对照组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 DAC与As2O3单药对NB4细胞的抑制作用呈浓度时间依赖性(DAC 1 μmol/L作用24、48、72 h的抑制率分别为12.18%、22.72%、35.54%;DAC 2 μmol/L作用24、48、72 h的抑制率分别增高为22.14%、31.18%、45.21%;As2O3 0.5 μmol/L作用24、48、72 h的抑制率分别21.09%、32.43%、44.93%;As2O3 1.0 μmol/L作用24、48、72 h的抑制率分别增高为31.69%、41.12%及54.27%),两药联合抑制作用较单药明显(DAC 1 μmol/L+As2O3 0.5 μmol/L作用24、48、72 h抑制率分别为42.10%、48.75%、60.78%)(P<0.05),各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义(P值均<0.05);As2O3 1 μmol/L作用于NB4细胞株48 h可见5.8%的细胞凋亡,联合组增高为17.3%.结论 DAC能显著抑制NB4细胞的增殖并诱导其凋亡,DAC联合As2O3对NB4细胞增殖抑制及诱导凋亡有协同作用.     

雷公藤红素体外抑制人类急性髓系白血病细胞的实验研究

目的 研究雷公藤红素体外对人类急性髓系白血病(AML)细胞的体外抑制作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术(FCM)等方法研究雷公藤红素对人类AML细胞的影响.结果 MTT实验显示,与空白组比较,培养不同时间后不同浓度组雷公藤红素的细胞增殖抑制率均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).FCM检测结果显示,1 μmol/L以上浓度雷公藤红素作用不同时间,AML细胞均可出现凋亡现象,凋亡率明显高于不加药物的对照组(P＜0.01).结论 雷公藤红素对AML有明显的抑制作用,其作用可能与其诱导细胞凋亡有关.     

葛根总黄酮诱导白血病细胞株凋亡及其分子机制的研究

目的 探讨葛根总黄酮(PR)对慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562和急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测PR对K562细胞、NB4细胞的增殖抑制率;光学显微镜及荧光显微镜观察细胞形态改变;Hoechest33258荧光染色AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率;DNA PI染色法分析细胞周期及亚二倍体峰.Western blot分别检测NB4细胞JNK、PARP、bcl-2、Caspase3,K562细胞bcr-abl、p53、bcl-2、Fas/FasL蛋白表达的变化.结果 12.5～200 μg/ml PR均能抑制K562、NB4细胞增殖.光学显微镜及荧光显微镜下观察到核固缩、凋亡小体等典型的细胞凋亡改变;Annexin V+/PI-细胞呈时间-剂量依赖性增加;DNA PI染色法发现细胞亚二倍体比例增加,G1期比例下降、S期比例增加.PR呈时间-剂量依赖性抑制K562细胞、NB4细胞增殖,诱导细胞凋亡.不同浓度PR干预后K562细胞bcr-abl蛋白水平呈浓度依赖性下调(F=18.74,P<0.05),而bcl-2则无明显变化;p53表达呈浓度依赖性上调;Fas/FasL表达无明显变化.NB4细胞JNK、PARP及Caspase 3蛋白表达与PR浓度呈正相关,与凋亡抑制蛋白bcl-2则呈负相关(F=42.32,P<0.05).结论 PR能有效抑制K562、NB4细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡,但分子机制不同.提示一定浓度PR具有较广谱的抗白血病效应.     

白藜芦醇诱导白血病Molt-4细胞凋亡及对WAVE1基因表达的影响

目的 探讨白藜芦醇诱导人类急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞凋亡的作用机制.方法 噻唑蓝比色法(MTF)测定细胞生长抑制率;流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率;半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测WAVE1基因的表达.结果 MTT结果显示:12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的白藜芦醇作用于Moh-4细胞24、48、72 h后,细胞的最大抑制率分别达到29.32%、36.11%、53.92%、62.50%、74.98%,并呈时间-剂量依赖性(F=33.614,P<0.05);流式细胞术检测结果显示:与对照组相比,50.0、100.0 μmol/L白藜芦醇作用于Molt-4细胞48 h后,S期细胞比例由42.2%分别上升为68.6%和78.1%,细胞发生了S期阻滞(F=19.453,P<0.01);PCR结果显示:50.0、100.0 μmol/L的白藜芦醇处理Molt-4细胞48 h后,WAVE1/GAPDH比值分别为0.356±0.03、0.382±0.05,与对照组(0.586±0.06)比较,差异有统计学意义(F=8.950,P<0.01).结论 白藜芦醇可诱导Moh-4细胞发生凋亡,其作用机制可能与下调WAVE1基因表达有关.     

Taurolidine联合X射线对小鼠恶性黑色素瘤细胞周期进程的影响

目的:观察taurolidine联合X射线照射对小鼠恶性黑色素瘤(B16-4A5和B16-F10)细胞周期进程的影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的发生机制.方法:选择B16-4A5和B16-F10细胞系按给药浓度随机分为4组,taurolidine剂量分别为0、25、50和100 μmol·L-1,同时进行1、2和4 Gy X射线照射,采用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting分析cyclin B、cdc2和caspase-3的表达.结果:与25 μmol·L-1 taurolidine组比较,50和100 μmol·L-1 taurolidine组诱导B16-4A5和B16-F10细胞发生G0/G1期阻滞,细胞数分别升高54.9%、73.7%和36.8%、55.5%(P＜0.05); 50 μmol·L-1 taurolidine联合2和4 Gy X射线照射组,细胞G2/M期阻滞消除,细胞数分别降低52.1%、44.2%和59.3%、52.7%(P＜0.05).与对照组、单纯taurolidine组及单纯照射组比较,联合4 Gy X射线照射组cyclin B和cdc2的表达降低,caspase-3的表达升高(P＜0.05).结论:taurolidine联合X射线照射可去除G2/M期阻滞,可选择地抑制肿瘤细胞cyclin B和cdc2的表达、增强caspase-3的表达,共同诱导细胞凋亡.     

增强子结合蛋白C/EBPα对白血病BALB/c裸鼠的肿瘤抑制作用

目的 探讨增强子结合蛋白C/EBPα在白血病裸鼠体内的肿瘤抑制作用.方法 将30只BALB/c裸鼠随机分转染组(10只)、空载组(10只)、对照组(10只),建立皮下瘤模型,并将30只BALB/c裸鼠如上分组建立白血病模型,将C/EBPα稳定表达细胞株pEGFP-C/EBPα-K562、空载细胞株pEGFP-K562及白血病细胞株K562分别经皮下和尾静脉注射到相应组裸鼠体内,形成皮下瘤和血液病模型.观测皮下肿瘤的变化,应用TUNEL检测细胞的凋亡,瑞特-吉姆萨染色观察血液病模型裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞增殖能力,RT-PCR检测增殖相关基因的表达.结果 皮下瘤模型中pEGFP-C/EBPα-K562组肿瘤质量及最大直径为(24±0.1)g和(11±2)mm,空载组和对照组分别为(5.1±0.3)g、(19±3)mm和(5.7±0.4)g、(23±3)mm(均P＜0.05),TUNEL检测发现pEGFP-C/EBPα-K562组肿瘤细胞凋亡明显增加(P＜0.05);血液病模型鼠外周血可见白血病细胞,pEGFP-C/EBPα-K562组白血病细胞增殖能力明显低于空载组和对照组,可见明显细胞分化现象,RT-PCR检测发现p53基因上调和c-myc基因下调.结论 增强子结合蛋白C/EBPα在白血病小鼠体内具有促进肿瘤细胞凋亡和抑制白血病细胞增殖的能力,并能促进白血病细胞分化.C/EBPα的白血病抑制作用可能是通过对相应基因的调控来实现.     

硼替佐米作用不同时间对K562耐药细胞株核因子-κ B途径的影响

目的 观察硼替佐米(商品名:万珂,PS-341)对柔红霉素(DNR)诱导的K562耐药细胞株(K562/DNR)核因子-κ B(NF-κ B)、抑制蛋白κ B(I κ B)及P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,探讨PS-341逆转耐药的分子机制.方法 以100μg/ml DNR单用或联合应用4μg/L PS-341分别作用于K562/DNR 12、24及36 h,检测不同时间点各组NF-κ B、Iκ B及P-gp表达情况,同时测定NF-κ B p65活性,检测各组细胞凋亡率.结果 Western blot结果显示:与阴性对照组相比,DNR可诱导NF-κ B表达上调及活性增强、I κ B表达下调、P-gp表达上凋;加用PS-341可显著抑制DNR诱导的NF-κ B及P-gp表达,使I κ B表达增加.加用PS-341后,NF-κ B活性12 h为(15.3±1.87)%[DNR组为(23.8±2.27)%],24 h为(10.2±1.69)%[DNR组为(25.4±1.98)%],36 h为(6.08±2.53)%[DNR组为(26.9±2.58)%],与相应单用DNR组相比均有明显下降,差异有统计学意义(P值均＜0.05).DNR与PS-341联用后,细胞凋亡率12 h为(35.23±5.15)%[DNR组为(15.56±4.12)%],24 h为(40.26±6.89)%[DNR组为(17.25±2.89)%],36 h为(43.58±7.69)%[DNR组为(22.47±4.58)%],与DNR组相比,细胞凋亡率均明显增加,差异具有统计学意义(P值均＜0.05).上述作用呈时间依赖性.结论 PS-341可减少K562/DNR细胞NF-κ B的活化,降低P-gp表达,逆转细胞耐药,促进细胞凋亡.     

吉西他滨联合树突状细胞对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:观察肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞(DC)联合吉西他滨(GEM)体外抑制肝癌HepG2 细胞系增殖的作用,为临床探索有效的肝癌综合治疗方案提供实验依据.方法:采用反复冻融法裂解HepG2 细胞,提取肿瘤细胞抗原后致敏DC,并以DC刺激自身T 细胞的增殖和活化.按不同处理因素分组:①空白对照组,只含空白培养液;②阴性对照组,只含HepG2 细胞;③单纯T 细胞组,将未经致敏DC 刺激的T细胞与靶细胞按20∶1 的比例接种;④单纯活化T 细胞组,将经致敏DC 刺激后的活化T 细胞与靶细胞按20∶1 的比例接种;⑤单纯GEM 处理组,靶细胞接种后在培养基中分别添加终浓度为50、100、150、200 μg·L-1 的GEM;⑥T细胞+GEM 处理组,在单纯T 细胞组的培养基中分别添加上述4个浓度梯度的GEM;⑦活化T 细胞+GEM 处理组,在活化T 细胞组的培养基中分别添加上述4个浓度梯度的GEM.MTT 法检测细胞杀伤率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,观察应用T 细胞、不同浓度的GEM 以及两者联合应用对HepG2 细胞的体外杀伤效应.结果:空白对照组刺激指数(SI)为1.34,阴性对照组SI 为3.48,两者比较差异有统计学意义(P<0.01).与单纯T细胞组[(4.81±2.54)%]比较,单纯活化T 细胞组细胞杀伤率[(21.68±4.39)%]明显升高(P<0.01);与活化T细胞+50、100 和150 μg·L-1 GEM组比较,活化T细胞+200 μg·L-1 GEM组细胞杀伤率明显升高(P<0.05).单纯T 细胞组细胞凋亡率为(5.45±0.94)%,与阴性对照组 [(4.47±1.98)%]比较差异无统计学意义(P>0.05);活化T 细胞组细胞凋亡率为(14.32±1.16)%,与前两组比较差异有统计学意义(P<0.01).活化T细胞+100 μg·L-1 GEM组细胞凋亡率为(24.52±0.85)%,与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论:负载肿瘤细胞抗原的DC 可诱导出抗肿瘤的细胞毒性T细胞,活化的T细胞联合GEM 能显著提高其杀伤肿瘤细胞的作用.     

环氧合酶-2抑制剂对白血病细胞HL-60的化疗增敏作用及机制

目的 观察环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对白血病细胞株HL-60的化疗增敏作用,并对其机制进行初步探讨.方法 MTT法评估塞来昔布、多柔比星及二者联合对HL-60细胞的生长抑制效应;流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Survivin基因的表达;Western blotting检测Survivin蛋白的表达.结果 多柔比星联合塞来昔布5和10μmol/L对HL-60细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为0.25及0.16μg/ml,明显低于多柔比星单用的IC50(0.48μg/ml);多柔比星0.10μg/ml联合10 μmol/L塞来昔布下调Survivin基因mRNA及蛋白的表达;联合塞来昔布5和10 μmol/L的凋亡率[分别为(13.07±1.66)%及(22.36±1.84)%]较多柔比星0.10μg/ml单用[(5.72±1.25)%]明显增加(P<0.01).结论 COX-2抑制剂塞来昔布对白血病细胞株HL-60具有明显的化疗增敏作用,其初步机制涉及下调Survivin的表达,增加细胞凋亡.     

β-羟基异戊酰紫草素二甲醚衍生物对白血病细胞株THP-1的作用

目的 选用人类单核细胞白血病细胞株THP-1,体外加入紫草素二甲醚衍生物5,8-二甲基-2-β-羟基异戊酰紫草素(SK36),研究其在THP-1细胞株增殖和凋亡中的作用,并对其作用机制进行初步探讨.方法 CCK法检测SK36对THP-1细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞早期凋亡标记Annexin V/PI及细胞凋亡通路Caspase活性;激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡和坏死.结果 流式细胞术检测结果显示,1.02μg/ml SK36作用24、48 h后的细胞凋亡率分别为(40.61±2.13)%和(67.40 ±9.15)%,明显高于对照组的(16.97±0.61)%,差异有统计学意义(t=18.444,t=9.528,P<0.01);SK36诱导THP-1细胞凋亡且经历了Caspase-3的激活(F=323.61,P<0.01).结论 紫草素二甲醚衍生物SK36能有效地诱导THP-1细胞凋亡,其作用机制主要是激活Caspase-3.     

Effects of cytosine arabinoside on human leukemia cells

Cytosine arabinoside (Ara-C) is used to treat leukemias, with complete remission induced by combination chemotherapy in approximately 70% of cases of acute myelogenous leukemia (AML). Ara-CTP acts as a competitive inhibitor of DNA polymerase and may also be incorporated into DNA. Accumulation of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) induced by Ara-C may indicate disruption of DNA synthesis in susceptible leukemia cells. A procedure has been developed for the quantification of Ara-CTP and dNTPs from small samples of leukaemia cells from patients (4 x 10(7) cells) activated with concanavalin A (10 micrograms/ml, 48 hr) and grown in the presence of [32P]orthophosphate (1.1 microM, 9 x 10(6) Ci/mol, 16 hr). The susceptibilities to Ara-C of the human leukemia cell lines CCRF-CEM (IC50 = 6.30 nM), CCRF-HSB-2 (IC50 = 10.4 nM) and MOLT-4 (IC50 = 10.0 nM) may be correlated with their abilities to accumulate high concentrations of Ara-CTP (> 1000 amol/cell) with increases of between 1.3- and 3.4-fold in dATP, dGTP and dTTP for the four cell lines, while dCTP decreased between 0.23- and 0.78-fold. By contrast, an Ara-C-resistant derivative of HL-60 cells (IC50 = 400 nM) accumulated only low concentrations of Ara-CTP (71 amol/cell) without significant changes in dNTPs. High concentrations of Ara-CTP in leukemia cells induce accumulations of dATP, dGTP and dTTP due to inhibition of DNA synthesis, and depletion of dCTP. This imbalance in the pools of the four dNTPs could lead to genetic miscoding and cell death.     

Enforced expression of Bcl-XS induces differentiation and sensitizes chronic myelogenous leukemia-blast crisis K562 cells to 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine-mediated differentiation and apoptosis

Human chronic myelogenous leukemia-blast crisis K562 cells have been demonstrated to be relatively resistant to antileukemic drug-induced apoptosis. This has been attributed to the activity of p210bcr-abl tyrosine kinase present in the K562 cells, which is known to suppress drug-induced apoptosis. Recently, K562 cells have been shown to express the antiapoptosis Bcl-xL but not Bcl-2 proteins. To investigate the contribution of Bcl-xL toward resistance to drug-induced apoptosis, we created K562/Bcl-xS and K562/neo cells by electroporating the expression plasmids pSFFVneo-Bcl-xS and pSFFVneo, containing the bcl-xS and neomycin resistance genes, respectively, into K562 cells. K562/Bcl-xS but not K562/neo cells expressed the bcl-xS mRNA and p19Bcl-xS protein. In contrast, both cell types expressed equivalent levels of Bcl-xL, Bax, Bcl-2, Myc, retinoblastoma, p21cbor-abl, and p145abl proteins. A significant increase in the hemoglobin levels was observed in the K562/Bcl-xS compared with the K562/neo cells (P < 0.05). In addition, K562/Bcl-xS cells were significantly more sensitive than K562/neo cells to undergoing erythroid differentiation induced by low-dose 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) and hexamethyl bisacetamide (P < 0.05), but not by all-trans-retinoic acid. Low-dose ara-C- or hexamethyl bisacetamide-induced differentiation was not associated with apoptosis of K562/Bcl-xS or K562/neo cells. Low-dose ara-C-induced erythroid differentiation was accompanied by conversion of the retinoblastoma protein to predominantly its underphosphorylated isoform as well as by down-regulation of Myc levels in K562/Bcl-xS and K562/neo cells. Importantly, exposure to high-dose ara-C (HIDAC; 100 microM ara-C for 4 h) caused internucleosomal DNA fragmentation and the morphological features of apoptosis in K562/Bcl-xS cells. These effects were modestly enhanced by cotreatment with HIDAC plus herbimycin A. In contrast, K562/neo cells were completely resistant to HIDAC- and herbimycin A-induced apoptosis. These results indicate that the expression of Bcl-xS induces erythroid differentiation and partially sensitizes chronic myelogenous leukemia-blast crisis-derived K562 cells to ara-C-induced differentiation and apoptosis.