高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。     

抗人CD25人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的稳定表达及初步鉴定

目的在CHO细胞中稳定表达抗人CD25人鼠嵌合抗体,并对抗体活性进行初步鉴定。方法采用脂质体法将嵌合抗体真核表达质粒pOptiVEC-H和pcDNA3.3-L共转染CHO-DHFR-细胞,通过去除HT和在培养基中加入500μg/ml的Geneticine进行阳性克隆的筛选,有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆,通过在培养基中加入浓度逐步增加的MTX提高克隆的抗体表达量。采用流式细胞术(FCM)检测嵌合抗体的抗原结合活性及人抗体重链Fc段、轻链κ链;提取细胞基因组进行PCR鉴定;抗体经超滤浓缩后,采用蛋白G亲和纯化法进行纯化,并进行Westernblot分析;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,采用ELISA法检测抗体分泌的稳定性。结果获得稳定分泌嵌合抗体的细胞株1C1,ELISA检测抗体表达量为103ng/ml;PCR结果表明,表达的质粒已整合入细胞基因组中;FCM及Westernblot结果显示,嵌合抗体含有人抗体重链Fc段及轻链κ链,且保留了鼠抗体V区的抗原结合特异性;经蛋白G亲和纯化后,获得抗体220μg,纯度>97%;体外连续培养细胞株2个月及冻存、复苏后,抗体分泌保持稳定。结论获得了稳定表达人CD25人鼠嵌合抗体的CHO细胞株,其具有鼠源抗体的抗原结合特异性及人抗体的恒定区。     

抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达

目的构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定。方法分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人Ig G1重链恒定区基因连接,VL基因与人Ig G1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入p Opti VECTM-TOPO誖TA载体,轻链基因连入pc DNATM3.3-TOPO誖TA载体,构建重链表达质粒p Opti VEC-H和轻链表达质粒pc DNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经Mab Select Sure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数。结果鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长。嵌合表达载体p Opti VEC-H和pc DNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确。经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml。纯化的嵌合抗体纯度达99%以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L。结论成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

目的构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行瞬时表达。方法采用RT-PCR技术,设计针对信号肽的简并引物,钓取抗CD25杂交瘤细胞的重、轻链可变区基因,以质粒PAG4622为模板,钓取人抗体IgG1重、轻链恒定区基因,分别将重、轻链可变区基因与相应的恒定区基因进行拼接,将完整的重、轻链嵌合基因分别与真核表达载体pOptiVEC和pcDNA3.3连接,构建抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒,将其通过脂质体法共转染至293T细胞中进行表达。通过RT-PCR法检测嵌合抗体基因的转录水平,ELISA法检测嵌合抗体的表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合活性。结果抗CD25人鼠嵌合抗体基因真核表达质粒构建正确;RT-PCR显示嵌合抗体基因在293T细胞中成功转录;转染后48、72、96和120h,细胞培养上清中嵌合抗体的含量分别为7.47、11.72、8.02和18.28ng/ml;FCM检测其能特异性与IL-2Rα链结合。结论已成功构建了抗CD25人鼠嵌合抗体基因的真核表达质粒,并能在293T细胞中瞬时表达。     

抗人CD4嵌合抗体的稳定表达及鉴定

目的构建抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,并对表达产物进行鉴定。方法采用脂质体法将抗人CD4嵌合抗体质粒pHDC4稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压筛选抗人CD4嵌合抗体稳定表达株,经细胞工厂扩大培养。收集培养上清,经Protein A亲和层析纯化目的抗体,激光共聚焦显微镜观察抗体基因在细胞内的表达,并分别进行质谱分析、蛋白质N-末端测序和平衡解离常数(KD)的测定。结果构建的抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株的抗体表达水平为4.29～10.52μg/ml;BCA测得纯化回收后的抗体表达水平为12.68 mg/L;激光共聚焦检测显示,抗CD4嵌合抗体稳定表达细胞株可稳定表达人的恒定区和鼠的可变区;质谱分析表明,其含有鼠源性和人源性成分;蛋白质N-末端氨基酸测序表明,其轻链与亲本抗体N-末端氨基酸序列完全一致;其KD为2.67×10-9M。结论成功构建了抗人CD4嵌合抗体稳定表达细胞株,其表达的抗人CD4嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合特异性和亲和力。     

抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的真核表达

目的在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中表达抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体。方法真核表达质粒PAG4622+CD4VL和PAH4604+CD4VH经酶切和序列测定后,采用电穿孔转染技术将二者共转染SP2/0细胞,经组胺醇和霉酚酸联合筛选阳性克隆,通过ELISA、流式细胞术、RT-PCR和DNA测序的方法进行初步鉴定。结果真核表达质粒经酶切和测序鉴定证明构建正确。获得2株分泌抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体的阳性SP2/0细胞克隆0925CASP2/0和1107CASP2/0,嵌合抗体表达量为0.5～2ng/ml。结论已成功地在SP2/0细胞中表达了抗人T淋巴细胞CD4人-鼠嵌合抗体,为该抗体在其他真核细胞中的高效表达及临床应用奠定了基础。     

人鼠嵌合抗体的基因构建

为了克服鼠单克隆抗体在人体治疗中出现的问题,经典的基因工程抗体技术将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒定区,即构建人鼠嵌合抗体。嵌合抗体不仅保留了亲本抗体的特异性和亲和力,大大降低了人抗鼠抗体(HAMA)反应,而且可表现出不同的生物学功能和半衰期。本文就嵌合抗体鼠抗体可变区基因的克隆、人抗体恒定区基因的钓取、鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因的拼接及表达载体和宿主细胞的构建作一综述。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性

目的在CHO细胞中共表达二氢叶酸还原酶(DHFR)基因及人神经生长因子β亚基(-βhNGF)基因,并对表达产物进行鉴定和生物活性分析。方法克隆DHFR和-βhNGF基因,测序,酶切,连接到真核表达载体pBudCE4.1中,构建人NGF基因重组表达质粒pBudCE4.1/DHFR/-βhNGF,经电转染法导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)中,经添加Zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+细胞克隆。经MTX加压筛选高表达-βhNGF的CHO细胞株。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定,并利用鸡胚背根神经节法检测表达蛋白的生物活性。结果人神经生长因子在CHO细胞中得到较高表达,表达量达0.3μg/ml,且表达产物具有良好的生物活性。结论为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了基础。     

抗人细胞间粘附分子-1嵌合抗体的制备及其生物学活性

目的构建抗人细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)嵌合抗体的真核表达质粒,在CHO-dhfr-细胞中进行表达,并检测其生物学活性。方法采用RT-PCR法从特异性分泌抗人ICAM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中扩增抗体VH和VL基因,从人淋巴细胞RNA中扩增人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列,再通过重叠延伸PCR连接鼠源性可变区基因片段与人源性恒定区基因片段,获得人-鼠嵌合抗体基因;将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体,构建嵌合抗体真核表达质粒;将质粒在脂质体LipofectAMINE介导下转染CHO-dhfr-细胞进行表达,表达的嵌合抗体经Protein A-Sepharose 4B亲和层析柱纯化后,紫外分光光度法测定抗体浓度,ELISA法检测嵌合抗体的特异性抗原结合活性及人源性,并进行还原性SDS-PAGE分析、Western blot分析及抑制细胞间黏附活性分析。结果嵌合抗体真核表达质粒pIRES-anti-ICAM-1经双酶切鉴定构建正确;嵌合抗体在真核细胞CHO-dhfr-中高效表达,培养上清中表达量可达0.5 mg/L;纯化的嵌合抗体经10%还原性SDS-PAGE分析,可见相对分子质量分别约为25 000的IgG轻链和50 000的IgG重链,相对分子质量约25 000的蛋白可被羊抗人IgGκ链所识别,而相对分子质量约50 000的蛋白可被羊抗人IgGγ链所识别;纯化的嵌合抗体可与羊抗人κ链或羊抗人IgG多抗呈强阳性反应,可与人ICAM-1抗原特异结合;该嵌和抗体具有良好的抑制内皮细胞与单核细胞黏附的活性。结论成功制备了抗人ICAM-1嵌合抗体,并在真核细胞中实现高表达,该抗体减少了鼠源性成分,降低了其免疫原性,为ICAM-1相关的炎性疾病的抗体治疗奠定了基础。     

弱化二氢叶酸还原酶基因增进人神经生长因子β亚基在CHO细胞中的表达

目的通过弱化二氢叶酸还原酶基因(Dihydrofolate reductase,DHFR)增进人神经生长因子β亚基(β-Humannerve growth factor,β-hNGF)在CHO细胞中的表达。方法从质粒pUC18-β-NGF中扩增β-NGF基因,克隆至pMD18-T载体,构建克隆质粒β-hNGF/pMD18-T;经人工合成弱化SV40启动子与DHFR基因顺式表达元件,并插入pBudCE4.1质粒,构建质粒w-DHFR/pBudCE4.1;分别双酶切质粒β-hNGF/pMD18-T和w-DHFR/pBudCE4.1后连接,转化大肠杆菌Top10’,构建重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1,转染CHO-DHFR-后,筛选阳性细胞克隆,ELISA法检测阳性CHO细胞株表达β-NGF的水平,鸡背根神经节增殖法检测重组β-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒β-hNGF/w-DHFR/pBudCE4.1经酶切和测序证明构建正确;共获得5株表达β-hNGF的CHO细胞株,且表达的β-NGF能使神经节出现明显的神经纤维,表达量为0.1μg/μl。结论通过弱化SV40启动子和DHFR基因,在CHO细胞中成功表达了β-hNGF基因,表达量增加且具有生物学活性。     

内部核糖体结合位点介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达

目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的三顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC~(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了三顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。     

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。方法用BamHⅠ和HindⅢ双酶切含有HCVC区、E2区模拟表位和NS3~NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达。以100μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果。结果所构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达。该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组。结论已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

一种新的鼠源性抗人免疫球蛋白多克隆抗体的制备法

应用小鼠常规免疫的方法,结合小鼠 SP2/0骨髓瘤细胞诱生腹水的原理制备鼠抗人免疫球蛋白(Igs)腹水。每只小鼠可产生腹水5ml,比小鼠血清高10～20倍,抗体滴度略低,但总特异性抗体的活性高于血清5～10倍。为应用鼠单抗进行免疫诊断提供了制备抗人 Ig 的实用方法,并可用于制备各种鼠源性多克隆抗体。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

人CD52基因的克隆及稳定转染细胞系的建立

目的克隆人CD52基因,构建真核表达载体,并在CHO细胞中稳定表达。方法提取人Hut-78细胞总RNA,采用RT-PCR法扩增CD52基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52,通过脂质体法转染CHO细胞,建立稳定转染的细胞系CHO-CD52。采用RT-PCR、免疫荧光组化技术及流式细胞术检测目的基因和蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增得到186bp的DNA片段。重组表达质粒pcDNA3.1(+)/CD52经PCR、双酶切及测序证明构建正确。CHO-CD52细胞经RT-PCR分析,可见186bp的目的基因条带;经免疫荧光检测,可见绿色荧光分布;经流式细胞术分析,阳性细胞百分率及荧光平均值分别为98.18和193.56。结论已成功克隆了人CD52基因,并建立了稳定转染的CHO细胞系,为CD52单克隆抗体的制备及抗体药物的开发奠定了基础。     

单抗制品中CHO细胞宿主蛋白残留双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的建立单抗制品中CHO细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)残留双抗夹心ELISA检测方法。方法确定双抗夹心ELISA方法的最佳工作条件,并对该方法的精密度和准确度进行验证,确定线性范围及最低检出限;用建立的方法与市售试剂盒分别检测低、中、高浓度HCP标准品及抗TNF-α单抗原液、抗VEGF单抗纯化工艺样品中的HCP。结果建立的双抗夹心ELISA法最佳抗体包被浓度为1.5μg/ml,酶标抗体浓度为1μg/ml,160 r/min,37℃孵育2.5 h;TMB 37℃孵育15 min;以630 nm为参比波长,450 nm为测定波长。该方法的线性范围为3.125~100 ng/ml,最低检测限为3.125 ng/ml;试验内变异系数(CV)和试验间CV均小于15%,回收率为85.3%~115.1%。与商品化试剂盒检测结果基本一致,可用于检测纯化工艺样品。结论已成功建立单抗制品中CHO细胞HCP残留双抗夹心ELISA检测方法,该方法可代替市售试剂盒用于CHO细胞HCP残留检测,可使检测成本降低30倍。     

犬干扰素α1基因在大肠埃希菌中的表达及其抗病毒活性的测定

目的在大肠埃希菌中高效表达重组犬干扰素α1(canine interferon alpha1,CaIFNα1)基因,并对其抗病毒活性进行初步研究。方法根据大肠埃希菌密码子的偏嗜性,人工合成犬干扰素α1成熟蛋白编码基因,同时引入大肠埃希菌EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,将改造后合成的CaIFNα1核苷酸序列定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-CaIFNα1,并进行PCR及双酶切鉴定;将鉴定正确的重组表达质粒pET-CaIFNα1转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗VSV病毒活性。结果重组表达质粒经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白CaIFNα1相对分子质量约39 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的61.5%,可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗CaIFNα1多克隆抗体特异性识别,在MDCK细胞上呈现较高的抗病毒活性,为2.0×106U/ml。结论已成功改造了CaIFNα1基因,并在大肠埃希菌中实现了高效表达,表达产物具有较高的抗病毒活性。     

抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体CHO工程细胞株的构建、筛选及表达

目的构建抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)人源化单克隆抗体CHO工程细胞株,并进行筛选及表达。方法将抗HER2抗体重链基因Fd及轻链基因VL分别克隆至同一质粒p RH上,将构建正确的重组表达质粒命名为p HER2。通过脂质体法将p HER2转染至二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞(CHO-DG44)中,筛选稳定表达的工程细胞株,进行ELISA及SDS-PAGE检测。同时对抗HER2抗体高表达细胞株进行batch模拟试验。结果从近10 000株克隆中筛选获得3株备选细胞株,命名为H6、H7和H9。细胞株培养上清表达的抗体仅能与重组HER2发生特异性结合;SDS-PAGE检测结果表明,于相对分子质量50 000和25 000处可见重链和轻链的目的蛋白条带。H6、H7和H9细胞株在简单的batch悬浮培养条件下周期约为1周,抗体水平随培养时间的延长而逐渐升高,H9细胞株表达水平最高,为0.52 mg/ml。结论本研究筛选获得的工程细胞株H9具有较高的抗HER2单克隆抗体水平,为靶向治疗HER2过表达的乳腺癌和胃癌等恶性肿瘤奠定了基础。