漆酶的分离与纯化

<正> 精纯的标准样品是漆酶研究的必要基础。1883年,Yoshida在日本漆树中首次发现漆酶。10年之后,G.Bertrand即对漆酶作了初步分离和纯化。本文拟对漆酶的分离纯化方法略作综述如次:     

漆酶的来源与分离纯化技术

漆酶最早是从漆树所产的生漆中发现的,广泛分布于高等植物和真菌,在昆虫和细菌中也有发现。它是一种含铜的多酚氧化酶,既是聚合酶,也是降解酶,参与愈伤组织形成、木质化过程、生漆成膜、氧化酚类、苯胺类等一系列有机化合物。漆酶的去甲基化作用可以使木质素降解,也能够参与自然界中花色的形成。漆酶的应用以分离纯化为基础,主要用到沉淀、透析、色谱、电泳等技术。     

杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶。以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带。两型漆酶分别命名为LacA和LacB。经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5~5.5之间。LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5molL-1和292.4nmol mL-1 min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0mol L-1和127.4nmol mL-1 min-1。     

云芝菌发酵产漆酶及其对靛蓝脱色的研究

采用云芝菌(Coriolus versicolor)摇瓶发酵生产漆酶,对主要的工艺参数进行了优化.研究结果表明:木质纤维废弃物木糖渣可用作云芝菌产酶的有效碳源,其适宜浓度为20.0 g·L-1;在培养基中添加10 0 g·L-1葡萄糖可以促进菌种的前期生长,有利于发酵后期漆酶的分泌合成;产酶培养基的最适C/N为20;适量的Cu2 和维生素C对漆酶的生成有明显促进作用,其适宜浓度分别为0.100 mmol·L-1和1.500 mmol·L-1.3.7 L自控式发酵罐中的产酶试验显示:最适通气量为100 L·h-1.在云芝菌的发酵进程中,前期主要为营养生长,产酶高峰期出现在发酵后期.在优化条件下发酵144 h,漆酶活力可高达2474.2 IU·mL-1.采用上述粗酶液处理靛蓝染料,当靛蓝浓度为50 mg·L-1,粗酶液用量为0.45%(Ⅴ∶Ⅴ)时,反应40 min,脱色率可达到94.8%.试验结果显示,漆酶在牛仔服生物整理及染整废水的脱色净化处理中具有良好的应用前景.     

糙皮侧耳菌漆酶的分离纯化及部分性质研究

对糙皮侧耳菌5.42产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、DEAE-Cellulose和SephadexA-50纯化,得到纯化18.1倍漆酶,得率36%,用PAGE检测为单一条带,用SDS-PAGE证明漆酶的分子量为61.4 kD,而用经过高效液相色谱分离的酶液进行质谱检测分子量为60.5 kD。该酶最适温度为40℃,最适pH为5.0。金属离子对酶活有很大的影响,其中K+、Mn2+、Cu2+有明显促进作用,Hg2+、Ag+、Ba2+等对酶活有明显的抑制作用。该酶与果胶酶按比例组合在一起,对荨麻生物脱胶取得良好的脱胶效果——木质素去除率为85%。     

灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质

灵芝超高压突变株G1502的发酵液经浓缩、DEAE-纤维素柱层析,纯化出一种漆酶。其最适作用温度为45℃,在不高于45℃的条件下保存5 h,残余酶活在97%以上;最适pH为4.4,在pH=3.8~6.6内保存,残余酶活在80%以上。漆酶催化愈创木酚的υmax和Km分别为2.28μmol.L-1.min-1和1.94×10-4mol.L-1。金属离子K+和Cu2+对酶有激活作用,Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、Ba2+对酶活有很大的抑制作用。     

漆树漆酶和真菌漆酶的异同研究

本文在文献的基础上 ,比较了漆树漆酶和真菌漆酶在结构、催化活性、氧化还原电势、等电点、反应动力学参数、分离纯化方法、生物学功能等方面的异同 ,并对此进行了解释 ;最后对漆酶的基础研究和应用研究进行了展望     

不同培养条件对云芝(Coriolus versicolor)木质素降解酶产酶影响的研究

本文研究了不同培养条件对云芝（Coriolusversicolor）三种木质素降解前产酶的影响，发现三种木质素降解酶即水质素过氧化物酶（Lip）、赖锰标木质素过氧化物酶，（Mnp）和漆酶的产生和培养条件关系很大，添加黎芦醇（VOH）能显著地提高三种酶的产量，当VOH浓度为1mmol／L时，可使木质素过氧化物酶产量提高10倍，添加Mn2＋对赖锰木质素过氧化物酶有促进作用，但对木质素过氧化物酶有抑制作用。提高其它微量元素（Cu2+，Fe2+,Zn2+，Ca2+）等同样能显著促进三种酶的产生。采用30信浓度时，赖锰木质素过氧化物酶的量要比1培浓度时提高6倍。三种酶的最适产酶pH相差很大，木质素过氧化物酶在pH4．5～5．5左右，赖锰木质素过氧化物酶在PH5．5～6.5左右，而漆酶则抵达pH3．5～4．0．Tween80在低浓度时（0.01％-0.02％）有一定的促进作用，而在高浓度则有抑制作用。C／N比则是影响产酶的另一因素，低碳培养基比低氮培养基更适宜三种木质素降解酶的产生。同时，在低氮培养基和低碳培养基下，上述因素对三种酶产生的影响也存在显著差异。这有可能是云芝的木质素降解酶在不同的C／N下其产生机理存在差异。     

白腐菌Coriolus versicolor的培养及产漆酶条件的研究

从液体和固体两种培养体系出发,探索不同培养条件对白腐菌分泌漆酶的影响。液体培养体系中,白腐菌的最佳生长和漆酶分泌条件是缓冲体系起始pH值为5.8、摇瓶转速为180r/min、装液量为100mL/500mL;在所有测试的碳源中,葡萄糖为最佳碳源,在二糖中以蔗糖为碳源,漆酶酶活相对较高,而多糖(如淀粉)不利于漆酶的生成。在所有测试的氮源中,硝酸铵和酒石酸铵组合为最佳氮源,氯化铵和尿素的效果次之,蛋白胨的效果最差。当碳源与氮源质量比(C/N)大于10∶1,即高碳低氮的培养条件有利于漆酶的生成。芳香化合物诱导剂ABTS浓度为0.5～1mmol/L时,对产漆酶的影响最明显,与限氮培养基中产酶相比可提高酶活5倍,约为230IU/mL;0.5mmol/L愈创木酚、1mmol/L阿魏酸和0.05mmol/L二甲基苯胺的添加可提高酶活约2～2.5倍;0.01mmol/L黎芦醇的添加可提高漆酶酶活约1.6倍。由于酪氨酸具有酚类化合物的特点,也可作为一种无毒的天然漆酶诱导剂。菌株漆酶活力在固体培养体系明显低于在液体培养体系。     

云芝、脉射菌产木质素降解酶的比较研究

对两种白腐菌——云芝(Coriolus versicolor)和脉射菌(Phlebia radiata)在静置液体培养条件下最适产漆酶和赖锰过氧化物酶(MnP)的培养液组成进行了比较研究,同时,还对此二菌在产酶过程中还原糖的消耗与蛋白质积累变化进行了检测分析。     

杂色云芝产木质纤维素酶及对稻草秸秆的降解

在外加碳源和氮源的固态稻草秸秆基质上,对杂色云芝生长过程中产酶活性、主要化学成分及结构进行了分析. 结果表明,不同的碳源、氮源浓度对所产酶活性有较大影响,除产半纤维素酶的最佳条件是低碳低氮外(0.15%的葡萄糖和0.03%氯化铵),其他如纤维素酶、木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶和漆酶产生的最佳条件都是高碳低氮(2%的葡萄糖和0.03%氯化铵). 各种酶在稻草秸秆的降解中起着关键作用,酶活性直接影响主要化学成分的降解率. 纤维素和半纤维素的降解对木质素的降解有明显的促进作用. 经过32 d的培养,稻草秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为65.39%, 45.11%和39.16%. 经过降解,秸秆结构发生了明显的变化.     

云芝木聚糖酶的培养和Tween80对其产酶的促进作用

本文研究了不同碳源和吐温80（Tween80）对云芝木聚糖酶产醇的影响，当以1％滤纸为碳源时，木聚精酶活最高可达11U／mL，用微晶纤维素为碳源时也能产生很高的木聚精酶．而以1％木聚糖为碳源时，只能产生很低的木聚精酶活．Tween80对木聚糖酶的产生具有明显的促进作用，分别可达3倍（微晶纤维素为碳原）和30％以上（滤纸为碳源），这主要由于Tween80能促进木糖耷醉的分泌，提高胞外木糖苷酶的活性。     

Black liquor detoxification by laccase of Trametes versicolor pellets

Black liquors from a soda pulping mill were treated with the white‐rot fungus Trametes versicolor to detoxify and reduce colour, aromatic compounds and chemical oxygen demand (COD). The fungus was used in the form of pellets in aerated reactors (fluidized, stirred and air‐pulsed reactors). Reductions in colour and aromatic compounds of 70–80% and in COD of 60% were achieved. During the different experiments, laccase activity was detected but neither lignin peroxidase (LiP) nor manganese peroxidase activities were detected, although T versicolor is able to produce these enzymes. Experiments also showed a LiP activity inhibitory effect produced by lignin. From the results obtained, it can be concluded that there is a relationship between laccase production and toxicity reduction. This correlation responds to the equation Laccase production = 1.57 LN (toxicity reduction) ?16.40. Copyright © 2003 Society of Chemical Industry     

高活性漆酶产生菌的发酵条件优化

对云芝菌产漆酶的发酵条件进行优化,考察C源、N源和诱导剂等因素对产酶的影响.结果表明:杂色云芝菌摇瓶产漆酶的最佳条件为葡萄糖1.25 g/L,羧甲基纤维素钠15 g/L,酵母膏15 g/L,KH2PO41 g/L,CaCl20.05 g/L,MgSO40.25 g/L,30℃、150 r/m条件下振荡培养,在72 h加入2 mmol/L 2,5-二甲基苯胺作为诱导剂,在96 h加入2 mmol/L Cu2+,经过7 d培养,菌的漆酶比活达到3 319.2 U/mL.     

不同云芝菌株腐朽杨木过程的扫描电镜研究

本文应用扫描电镜观察研究了白腐菌云艺（Coriolusvericolor）三个菌株腐朽杨木的过程，对试材的显微形态变化以及各菌株的降解特性进行了详细描述和探讨．实验结果表明，三个菌株降解木材的性能和方式存在着差异。NFU008对木质素和纤维素均具有很强的降解能力，它在腐朽早期优先降解胞间层中的木质素并能使纤维解离，在腐朽后期，它对纤维素产生强烈降解。NFU006对木质素和纤维素的降解是同时进行的，但对纤维次生壁中木质素的降解率明显高于对纤维素的降解率。NFU019降解木质素的能力相对较弱，但对纤维素的降解能力却很强，早期它以降解出生壁的木质素为主，而在腐朽后期它对纤维素产生剧烈降解。三个菌株最终均造成纤维细胞壁不同程度的减薄和破坏。