一次性培养瓶在水痘减毒活疫苗生产中的应用

目的比较一次性培养瓶与方瓶培养人二倍体细胞2BS株的效果。方法接种相同浓度的人二倍体细胞2BS株至一次性培养瓶和小方瓶中,(37±0.5)℃静置培养3 d,于显微镜下观察细胞生长状态,并进行细胞计数。用0.025～0.05 MOI水痘-带状疱疹病毒Oka株感染2BS细胞,(35±0.5)℃静置培养3 d,待细胞病变达70%以上时,收获病变细胞,制备冻干水痘减毒活疫苗,并参考水痘减毒活疫苗注册标准及《中国药典》(三部)2010版,进行各项指标检定。结果在接种2BS细胞浓度相同的情况下,与方瓶相比,一次性培养瓶可增加一定的细胞培养面积,细胞总数相对较高;一次性培养瓶培养的2BS细胞贴壁速度较快,呈梭形,密度高,方向性好,轮廓清晰,分布均匀,胞质饱满,而方瓶培养的2BS细胞贴壁速度较慢,生长不均匀;使用一次性培养瓶及方瓶培养2BS细胞生产的水痘减毒活疫苗,各项检定指标结果均符合《中国药典》(三部)2010版相关要求,在病毒滴度无明显差异的情况下,使用一次性培养瓶可使水痘疫苗产量大幅度增加。结论使用一次性培养瓶培养人二倍体细胞2BS株生产的水痘减毒活疫苗疫苗产量较方瓶有较大幅度的提高。     

水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)中感染复数的分析

目的探讨水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)上的感染活性,确定感染复数(MOI)。方法使用100 ml小方瓶培养人二倍体细胞(2BS株),待长成致密单层后,接种病毒滴度为5.5 lgPFU/ml的水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株),每瓶接种量分别为0.02、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5和2 ml,于显微镜下连续观察细胞病变情况及病变比例,并连续记录收获时间;采用蚀斑法测定病毒滴度。结果当病毒接种量为0.02 ml时,细胞大部分生长正常,呈极性排列,无形态典型、广泛的病变,通过延长收获时间也无法获得形态典型、广泛的病变;当病毒接种量不低于0.1 ml时,呈典型、广泛的病变,随着病毒接种量的增加,收获时间逐渐缩短;仅病毒接种量为0.02 ml组细胞的病毒滴度低于3.7 lgPFU/ml;确定MOI在0.004 0~0.019 9之间,均可制备出质量稳定、符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求的毒种。结论确定了水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)感染人二倍体细胞(2BS株)合适的MOI,为水痘疫苗生产工艺的优化提供了参考依据。     

多层细胞工厂在水痘-带状疱疹减毒毒种(OKa株)传代中的应用

目的改进水痘-带状疱疹减毒活疫苗毒种(OKa株)培养方法,提高毒种的均一性及稳定性,延长保存时间。方法分别采用原培养方式(2 L方瓶培养法)和改进的培养方式(40层细胞工厂)制备水痘-带状疱疹病毒OKa株工作种子批,检测病毒滴度及-65℃以下保存1、3、6、12个月的稳定性,并用该种子批分别制备3批水痘减毒活疫苗后,进行疫苗成品的全面检定。结果 2 L方瓶培养法和40层细胞工厂制备的水痘-带状疱疹病毒工作种子批OKa-2015[1]C和OKa-2015[2]C的病毒滴度分别为6.1和6.0 lg PFU/ml;无菌试验、支原体检查、鉴别试验、外源因子检查结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求;-65℃以下保存12个月,滴度均无明显下降。两种培养方式各制备的3批疫苗成品的各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,各批疫苗的病毒滴度及37℃热稳定性差别不明显。结论 40层细胞工厂制备水痘-带状疱疹病毒毒种(OKa株),-65℃以下长期保存具有稳定性,该培养方式可提高毒种的均一性,降低微生物污染风险。     

不同生产工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的比较

目的采用细胞工厂替代传统转瓶工艺制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)。方法分别用细胞工厂和3 L转瓶培养2BS细胞,制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)各6批,采用Countstar全自动细胞计数仪进行细胞计数,并以计数结果中的单位面积细胞数、成活率及消化后细胞的平均直径为指标,考察细胞质量,同时采用蚀斑法检测原液、成品及成品37℃放置7 d后(热稳定性)的病毒滴度。结果采用细胞工厂连续制备的6批2BS细胞的平均单位面积细胞数、细胞平均成活率均略优于3 L转瓶培养工艺,平均直径变动范围小于3 L转瓶;细胞工厂制备的6批疫苗,平均原液滴度为5.58 lg PFU/ml,平均成品滴度为4.78 lg PFU/0.5ml,37℃放置7 d后的平均病毒滴度为4.13 lg PFU/0.5ml,优于3 L转瓶。结论利用细胞工厂制备水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株),可获得更高滴度病毒液,降低疫苗生产过程中的劳动强度及污染风险,并提高了疫苗产量及质量的稳定性,适合于水痘减毒活疫苗(VZV 84-7株)的规模化生产。     

麻腮风水痘联合减毒活疫苗中水痘病毒滴定方法的比较

目的探讨麻腮风水痘联合减毒活疫苗(measles,mumps,rubella and varicella combined vaccine,live,MMRV)中水痘病毒在人二倍体细胞(MRC-5和2BS)上蚀斑的形成情况,建立不中和法检测MMRV中水痘病毒滴度,并进行验证。方法观察麻疹、腮腺炎和风疹病毒在人二倍体细胞上形成的细胞病变形态,以及风疹病毒对水痘病毒蚀斑形成的影响;通过完全中和、部分中和以及未中和等方法,检测MMRV中水痘病毒的滴度,最终建立不中和法检测水痘病毒滴度,并对方法进行重复性和准确性验证。结果风疹病毒不高于4.0 lg CCID50/孔时,水痘病毒在MRC-5或2BS细胞中产生的蚀斑形态发生微小改变,但蚀斑数量与完全中和风疹病毒后差异无统计学意义(P0.5)。采用完全中和、部分中和以及未中和等方法检测MMRV中水痘病毒的滴度差异无统计学意义(P0.5),且不中和法检测水痘疫苗病毒滴度的重复性(RSD为2.3%)和准确性(回收率为97.8%~100%)均较好。结论在人二倍体细胞(2BS或MRC-5)上,不使用抗血清中和直接进行四联疫苗中水痘病毒的滴度检测完全可行,可替代MMRV中经典的使用抗体中和的病毒滴定方法。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用

目的采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗。方法用细胞工厂和15 L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100%时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品。采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性。结果采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50/ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10CCID50/ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50/ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50/ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37℃放置2 d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10CCID50/0.1 ml,于2~8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50/0.1 ml,均符合WHO的标准要求。结论利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产。     

两种水痘减毒活疫苗效力检测及结果评价

在对比利时生产的水痘减毒活疫苗VarilriTM和上海生物制品研究所引进日本生产线生产的水痘减毒活疫苗进行注册检定的同时，又对这两种产品的效力包括热稳定性进行了初步比较；并分别将我国二倍体细胞2BS以及国外二倍体细胞MRC－5用于疫苗效力检测。结果在2BS上滴定结果比在MRCS上稍低，VarilrixTM的滴度略高于上海所引进生产的水痘疫苗，但差异无显著意义（P＞0．05），而37℃7天热稳定性则后者优于前者（P＜o．01）。     

聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗的研制

目的研制安全有效的不含人血白蛋白稳定剂的风疹减毒活疫苗。方法将风疹减毒活疫苗毒种RA27/3株按适当比例接种单层人二倍体细胞MRC-5株,使用无血清、无蛋白的CDM培养基培养病毒,收获病毒液,加入聚乙烯吡咯烷酮作为病毒稳定剂,制备疫苗原液,加入冻干保护剂,制备5批冻干疫苗,进行各项检定。另取1批原液样品,分别加入聚乙烯吡咯烷酮和人血白蛋白作为病毒稳定剂,制成疫苗,进行各项检测。结果5批疫苗各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。同1批原液制备的聚乙烯吡咯烷酮与人血白蛋白稳定剂疫苗的病毒滴度和热稳定性无明显差异。37℃放置6周,两种稳定剂疫苗的病毒滴度均为3.63LgCCID50/ml。结论聚乙烯吡咯烷酮稳定剂风疹减毒活疫苗质量符合《中国药典》三部(2005版)的要求。     

不同细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗质量比较

目的　比较人二倍体细胞 2BS株与鸡胚细胞制备的麻疹减毒活疫苗质量。方法　观察两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗的病毒滴度、稳定性、抗体阳转率及GMT。结果　两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗的病毒滴度分别为 4 75、4 6 4和 4 83LgCCID50 ml,热稳定性良好 ,低温保存 2 0年的滴度无明显下降 ;人体免疫接种后均未出现局部与全身反应 ,抗体阳转率均为 10 0 % ,GMT分别为 36 14、2 8 38和 78 76。结论　两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗质量无明显差异