应用柱层析法纯化Vero细胞乙型脑炎疫苗

浓缩Vero细胞乙脑疫苗经SepharoseCL－6B柱层析可去除大部分杂蛋白，再经SphacrylS－500HR层析可进一步去除比病毒大的杂质及残余小分子量杂蛋白。经两步凝胶过滤层析纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％，抗原比活性提高87～165倍，抗原回收率达30％～50％，残余牛血清和残余细胞DNA均符合WHO有关规程要求，提纯疫苗的效力达到或超过中国地鼠肾灭活乙脑疫苗和日本提纯鼠脑拔苗的参考苗。     

用硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞乙型脑炎疫苗中残余DNA

通过试验研究建立一种去除Vero细胞乙脑疫苗中残余细胞DNA的方法，即疫苗经超滤浓缩后加入0.8～1.0mg／ml的硫酸色精蛋白，于4℃静置2h，8000r／min离心5min。DNA与鱼精蛋白共同沉于管底。用该法处理的疫苗不仅使残余DNA达到规程要求（＜100pg／剂量），而且抗原活性无明显丢失。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。     

应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。     

应用柱层法纯化Vero细胞乙型脑炎疫苗

浓缩Ｖｅｒｏ细胞乙脑疫苗经ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱层析可去除大部分杂蛋白，再经ＳｐｈａｃｒｙｌＳ－５００ＨＲ层析可进一步去除比病毒大的杂质及残余小分子量杂蛋白。经两步凝胶过滤层析化后，疫苗总蛋白含量减少约９９％，抗的比活怀提高８７－１６５倍，抗原回收率达３０－５０％，残余牛血清和残余细胞ＤＮＡ均符合ＷＨＯ有关规程要求，提纯疫苗的效力达到或超过中国地鼠肾灭惭脑疫苗和日本提纯鼠脑疫苗的参考苗。     

麻疹乙脑二联活疫苗的试制

应用麻疹沪191株制备的疫苗原液与乙脑SA14-14-2株制备的疫苗原液混合制成二联疫苗，经试验其病毒滴度与其同批单价苗差异无显著意义（P＞0．2），联合苗与相应的标准抗血清均有高度的特异性，免疫小鼠后以乙脑JEP3株强毒攻击的保护效价与其单价乙脑苗差异亦无显著意义（P＞0．5）。表明两株病毒无干扰现象。试制3批二联苗，经全面检定，结果完全符合现行规程要求。其中病毒滴度麻疹苗为4．5LogCCID50／ml，乙脑苗为6．11～6．18LogPFU／ml，安全试验表明，二联合苗的弱毒力特性稳定。     

不同方法制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的质量比较

目的比较不同纯化方法制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的质量。方法用柱层析一步法、两步法、区带离心法纯化工艺制备Vero细胞乙脑纯化疫苗各3批,比较杂蛋白去除率、抗原比活性、纯度、HCP残留。结果3组杂蛋白去除率分别为97.0%、99.1%和99.6;抗原比活性分别为0.35、0.59和0.68EU/μg;抗原回收率分别为82.3%、49.6%和30.3%;HCP残留量分别为10.40、0.70和0.13μg/ml,纯化液中每微克蛋白中残余HCP(ng)的含量平均为139.3、32.9和9.3ng。结论蔗糖梯度离心法制备的Vero细胞乙型脑炎疫苗抗原活性、纯度、杂蛋白去除效果、HCP残余量均优于两种柱层析法。两步柱层析法优于一步法。     

乙型脑炎灭活疫苗Vero细胞适应毒种的研究

将乙脑P3株鼠脑毒种在Vero细胞中适应性传代，当传至10代时，毒种的CPE和感染性虽无明显变化，但其免疫原性却明显减弱，因此，用在Vero细胞中传递1至2代的几株建立毒种库（P3V1和P3V2），其涵度分别为7．71和78210gpfu／ml。在毒种中加入以山梨醇为主要成分的稳定剂后，4～S℃保存30天，－30℃1年，－60℃2年，滴度降低约0．51ogpfu／ml，在生产中使用效果良好。     

病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒的适用性验证

目的对病毒类疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒进行适用性验证。方法将不同细胞基质制备的乙型脑炎灭活疫苗、人用狂犬病病毒疫苗共16批编盲后,每批疫苗均质等量分为44份,分别分发给3个实验室,用同批ELISA-Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒进行检测,对试剂盒进行适用性验证,考核试剂盒的专属性、精密性、线性和范围等指标。结果3个实验室检测每批样品44次,原代地鼠肾细胞和鸡胚细胞为基质的疫苗检测结果均为阴性,以Vero细胞为基质的疫苗检测结果均为阳性。16份样本44次检测结果的变异系数在7.34%～14.77%之间,均低于15%;相对线性范围在12.5～400 ng/ml之间。16份疫苗中6批Vero细胞乙脑疫苗和5批人用狂犬病病毒疫苗检出的细胞宿主蛋白残留量分别在153.3～5 850.9 ng/ml和1 895.7~40 625.1 ng/ml之间。结论疫苗中Vero细胞宿主蛋白残留量检测试剂盒具有较好的专属性、精密性和线性,可用于Vero细胞为基质的病毒类疫苗宿主蛋白残留量的检测。     

酶标法相对定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白

目的　建立定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白 (hostcellprotein ,HCP)的方法 ,并用该方法检测Vero细胞乙脑疫苗中HCP含量。方法　模拟Vero细胞疫苗生产工艺 ,制备Vero细胞HCP及其免疫血清 ,经过DEAEProteinASepharoseCL -4B亲和层析 ,制备纯化的抗Vero细胞HCPIgG。通过对检测条件的优化 ,确立了酶标法相对定量检测Vero细胞疫苗中宿主细胞蛋白的方法 ,并用该方法对Vero细胞乙脑疫苗的收获物、中间产品及纯化样品收样前杂蛋白中HCP进行定量分析。结果　该方法可以检测Vero细胞疫苗加入保护剂前任何阶段产品中HCP含量。结论　ELISA法可以相对定量检测Vero细胞HCP的含量。     

乙型脑炎活疫苗与灭活疫苗诱导小鼠体液和细胞免疫应答的比较

应用检测特异性CTL活性的方法检测乙脑活疫苗的细胞免疫应答 ,并以灭活疫苗作对照。结果显示活疫苗免疫小鼠后诱导的CTL均值为 79 2 % ,较灭活疫苗 2 9%高 5 0 2 % ,表明活疫苗具有较强的特异性CTL活性。用同批活疫苗免疫小鼠后其中和抗体效价为 1:5 ,而同批的灭活疫苗为 1:2 0 ,活疫苗的免疫效力 (ID5 0 ) 3 6× 10 6(ml)显著高于灭活疫苗的 4 0× 10 - 4 ～ 4 2× 10 4(ml)。表明乙脑活疫苗诱导的免疫应答中细胞免疫在保护效力中占有重要地位。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺。方法以Vero细胞作为乙型脑炎病毒增殖的细胞基质,使用微载体Cytodex-Ⅰ在15L生物反应器中进行高密度培养,采用2.5～4.5g/L的载体浓度培养乙型脑炎病毒,制备3批纯化乙型脑炎疫苗并进行检定。结果随着微载体浓度的增加,细胞密度升高。采用2.5～4.5g/L微载体培养的病毒收获液的平均滴度为7.38～7.56lgPFU/ml,收获量最高可达到12～15个有效罐体积。制备的3批疫苗各项质量指标均符合《中国药典》三部(2005版)相关要求。结论已建立了15L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

应用7.5 L生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的应用7.5 L生物反应器,培养Vero细胞和乙型脑炎病毒,规模化生产乙型脑炎灭活疫苗。方法应用7.5 L生物反应器,分别以5、10、15、20、25 g/L的微载体密度加装,采用灌流方式培养Vero细胞,分别将P3株乙型脑炎病毒按0.005 00、0.002 50、0.001 60、0.001 25、0.001 00 MOI接种至生物反应器内,收获乙脑病毒液。经浓缩、灭活、纯化等工艺制备疫苗半成品,经疫苗灭活及纯化试验进行工艺验证,合格后分装为疫苗成品,按照《中国药典》三部(2010版)中《冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)》要求,进行疫苗全项检定。结果当微载体密度为20、25 g/L时,细胞密度可达1.2×107个/ml,病毒滴度平均达8.33～8.52 lgLD50/ml;当病毒接种量为0.001 25 MOI时,病毒最高滴度可达9.02 lgLD50/ml。经超滤浓缩后的病毒原液,使用1∶4 000β-丙内酯灭活72 h,可达到灭活效果;纯化后可去除90%以上杂蛋白。应用7.5 L生物反应器生产的6批乙型脑炎灭活疫苗,经检定各项指标均符合国家要求。结论应用7.5 L生物反应器培养Vero细胞和P3株乙型脑炎病毒,经连续灌流收获,可规模化生产Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗。     

流行性乙型脑炎活疫苗流行病学效果观察

1991年对58645名1～7岁儿童进行了乙脑活疫苗流行病学效果观察,接种乙脑活疫苗组29639人,发生乙脑2例,发病率为6.75/10万;未接种组29006人,发生乙脑46例,发病率158.59/10万,二者差异显著(x~2=39.49,P<0.005),疫苗当年保护率95.74％、保护比1:23.49,高于国内灭活疫苗报告的结果,同时,活疫苗对病情的轻重和转归有良好的影响.而且使用简便安全。     

冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液的筛选

目的筛选冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液。方法分别以0.01 mol/L PBS和Earles液为缓冲液,右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸不同组合构成的冻干稳定剂,制备乙型脑炎减毒活疫苗半成品及冻干疫苗成品,观察在不同温度存放不同时间的稳定性,并检测不同配方冻干稳定剂的崩解温度(Tc)。结果 12种配方冻干稳定剂制成的疫苗半成品可在4℃1周内保持滴度稳定性,在25℃3 d内保持滴度无明显变化,3 d后滴度大幅下降;以0.01 mol/L PBS为缓冲液的稳定剂制备的疫苗的Tc值低于Earles液,以Earles液为缓冲液的D2和F2配方制备的冻干疫苗成品,在4℃及37℃放置1周后,滴度均>5.7 logPFU/ml。结论已筛选出以Earles液为缓冲液,含右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸的稳定剂配方,用于制备冻干乙型脑炎减毒活疫苗具有良好的保护效果。     

篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗

目的建立篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。方法利用7.5L篮式生物反应器和片状载体培养Vero细胞,接种乙型脑炎病毒P3V2株毒种,根据葡萄糖的消耗量,分析细胞的生长情况及调节病毒培养时的灌流速度,每24h取样,检测病毒滴度。收获的病毒液经纯化后,制备乙脑灭活疫苗,检测各项指标。结果Vero细胞培养至96h,葡萄糖消耗量达高峰,细胞密度达峰值;接种病毒后72h,葡萄糖消耗量达高峰,灌流量为7L/d,连续收获7～9d,共可收获(40±5)L病毒液;96h病毒滴度达高峰,为10.0LgLD50/ml;制备的乙型脑炎灭活疫苗各项指标均达到《中国药典》三部(2005版)要求。结论已建立了篮式生物反应器制备Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的工艺。