谷氨酸脱羧酶工程菌的发酵工艺及酶学性质

对谷氨酸脱羧酶(GAD)工程菌DM201的发酵及转化条件进行优化,分析了发酵过程中异丙基-β-D-巯基半乳糖苷(IPTG)诱导条件、转化体系pH、底物浓度和金属离子等因素对谷氨酸脱羧酶活力的影响。发酵过程中最佳IPTG诱导条件为:浓度0.4mmol/L、时间5h、温度30℃;转化温度45℃,pH=4.0,ρ(L-谷氨酸)≈110g/L,镁离子在50mmol/L和5mmol/L浓度时对谷氨酸脱羧酶酶活有稳定作用,铜锌离子对其酶活的抑制作用显著。     

L-谷氨酸氧化酶高密度发酵及催化合成α-酮戊二酸

以乳糖代替异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂,优化补料策略提高菌体密度,优化诱导策略提高蛋白表达,以高密度发酵所得L-谷氨酸氧化酶(LGOX)全细胞转化L-谷氨酸生产?-酮戊二酸(?-KG).结果表明,摇瓶培养条件下LGOX酶活由IPTG诱导的3.12 U/m L提高到4.78 U/m L;通过指数补料与DO-stat补料相结合的两阶段补料策略,5 L发酵罐中细胞浓度由IPTG诱导的2.49 g/L提高到41.6 g/L,LGOX酶活为59 U/m L.优化诱导策略后细胞浓度为48.4 g/L,LGOX酶活提高到156.1 U/m L,分别是优化前的19.4和50倍,?-KG产量达5160 g/L,提高48倍.     

重组真菌腈水解酶的发酵工艺条件及生物催化特性初探【需加急】

对产真菌腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、p H和温度进行了系统考察。摇瓶发酵优化结果显示:以甘油作为主要碳源,蛋白胨和酵母膏作为主要氮源,并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基,最适接种量为0.5%;较优的诱导剂诱导条件为:采用0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h,发酵p H=7.5,诱导温度25℃时产酶效果最佳。经过优化后,重组酶的酶活得到了显著提高,总酶活最高达到了3.84 U/m L,相比初始水平(0.84 U/m L)提高约4倍。5 L发酵罐的放大实验表明,产酶效果良好,总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。全细胞催化性质考察研究结果表明,该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45℃,最适反应p H约为7.2。     

转氨酶ATA117基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的重组表达及产酶条件优化

采用基因工程的方法构建重组大肠杆菌得到重组菌Eco(p ETDuet-ATA117),实现了转氨酶ATA117的重组表达。使用响应面法对重组大肠杆菌摇瓶发酵产酶培养基进行了优化并对转氨酶诱导条件进行研究。首先采用二水平部分因子设计筛选确定培养基中对转氨酶ATA117酶活有显著影响的3种培养基组分,即甘油、酵母粉和胰蛋白胨。然后进行最陡爬坡实验确定最佳响应面区域,最后通过Box-Behnken设计确定各成分的最佳浓度。采用该优化培养基,转氨酶酶活为391.7 U/L,分别是基础培养基和单因素优化培养基酶活的3.13倍和1.22倍。对转氨酶的诱导条件进行了研究,得出最适诱导温度24℃,光密度值(OD)为0.8,此条件下进行诱导,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1 mmol/L,诱导时间15 h,最终转氨酶活力达到713.7 U/L。     

重组真菌腈水解酶的发酵工艺条件及生物催化特性初探

对产真菌腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、p H和温度进行了系统考察。摇瓶发酵优化结果显示:以甘油作为主要碳源,蛋白胨和酵母膏作为主要氮源,并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基,最适接种量为0.5%;较优的诱导剂诱导条件为:采用0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h,发酵p H=7.5,诱导温度25℃时产酶效果最佳。经过优化后,重组酶的酶活得到了显著提高,总酶活最高达到了3.84 U/m L,相比初始水平(0.84 U/m L)提高约4倍。5 L发酵罐的放大实验表明,产酶效果良好,总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。全细胞催化性质考察研究结果表明,该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45℃,最适反应p H约为7.2。     

添加甲萘醌促进嗜热子囊菌合成过氧化氢酶

研究了添加甲萘醌对嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)IFO9862合成过氧化氢酶(CAT)的影响. 结果表明,添加甲萘醌有助于促进CAT的合成. 在发酵的24或48 h分别添加1 mmol/L的甲萘醌,发酵终了CAT酶活比对照分别提高了11.0%和23.1%;而在发酵的36和48 h各添加1 mmol/L的甲萘醌,CAT酶活可提高32.5%. 在发酵0 h添加88 mmol/L的H2O2,同时在48 h添加1 mmol/L的甲萘醌,CAT酶活达到1725 U/mL,比对照(1074 U/mL)提高了60.6%.     

不透明红球菌生产谷氨酸氧化酶发酵过程优化

优化了用不透明红球菌FMME1-41所产谷氨酸氧化酶(LGOX)转化L-谷氨酸产α-酮戊二酸(α-KG)的工艺条件.结果表明,最佳发酵培养基为酵母粉6 g/L,大豆蛋白胨2 g/L,(NH_4)_2SO_4 0.8 g/L,葡萄糖25 g/L,KH_2PO_4 3 g/L,MgSO_4 0.6 g/L,MnSO_4 0.3g/L,L-谷氨酸2.5 g/L,在其中发酵30 h,LGOX酶活达6.12 U/mL;在7.5 L发酵罐中优化发酵放大和补料策略,发酵40 h后LGOX酶活达21.5 U/mL;在2 L发酵罐中转化L-谷氨酸生产α-KG,产量达92.0 g/L,摩尔转化率为92.6%,生产强度为9.2 g/(L·h).     

表达重组谷氨酸脱羧酶工程菌发酵条件的优化

目的对表达谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,EC4.1.1.15,简称GAD或GDC)的重组大肠杆菌的发酵条件进行优化。方法通过单因素试验优化表达GAD的重组大肠杆菌B3C1的诱导剂IPTG添加时间、IPTG浓度、诱导时间、诱导温度,再经响应面分析法优化工程菌的发酵条件(氯化钠、胰化蛋白胨、酵母粉、摇床转速、初始pH值、培养时间、接种量、装液量)。结果工程菌的最佳诱导条件为:IPTG添加时间为工程菌接种后4 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为35℃;工程菌的最佳发酵条件为:酵母粉1.01%,氯化钠0.6%,胰化蛋白胨1.5%,培养时间11.25 h,摇床转速250 r/min,初始pH值6.5,接种量3.0%,装液量11.70 ml。工程菌在该条件下发酵培养,GAD酶活达1 227.33 U,比优化前提高了12.29%。结论已成功对表达GAD的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,为其工业化生产奠定了基础。     

氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化. 结表明,酶活最高可达到14.20 U/mL,产酶最佳培养基成分为：淀粉10 g/L、磷酸氢二钾9 g/L、麦芽浸膏25 g/L、硫酸镁1 g/L、胰蛋白胨55 g/L,最适发酵温度为37℃,最佳接种量4%. 在3 L发酵罐中采用最优发酵条件,酶活在16 h达到18.03 U/mL.     

添加羟胺诱导Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加羟胺对Streptomyces hygroscopicus合成谷氨酰胺转胺酶的影响. 结果表明,添加羟胺可诱导谷氨酰胺转胺酶的合成. 摇瓶培养过程中,羟胺的最适添加量和最适添加时间分别为0.5 mmol/L和38 h,发酵结束时,谷氨酰胺转胺酶酶活最高达到5.3 U/mL,比对照提高了32.5%. 添加羟胺可诱导Streptomyces hygroscopicus产酶,羟胺与谷氨酰胺转胺酶反应的结果是产生了L-谷氨酸-g-单羟肟酸,实验证明它对Streptomyces hygroscopicus产酶有抑制作用. 诱导产酶过程是羟胺的促进作用和L-谷氨酸-g-单羟肟酸的抑制作用逐步达到平衡、最后酶活趋于稳定的过程.     

重组大肠杆菌产胆固醇氧化酶的指数流加策略

以指数流加策略高密度培养重组大肠杆菌,发酵生产胆固醇氧化酶。通过对比生长速率的分阶段控制使得细胞干重达40.128g/L。确定了最佳的诱导时机为菌体对数生长期的中期,产酶速率为1287.31U/(L·h)。菌体产酶水平达6436.56U/L,生产强度为459.75U/(L·h),实现了胆固醇氧化酶的高效生产。     

氧对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇代谢的影响

考察了氧对Klebsiella pneumoniae发酵产1,3-丙二醇(PDO)代谢的影响. 研究结果表明,在厌氧或供氧条件下,K. pneumoniae都能利用甘油产PDO. 起始甘油浓度20 g/L,发酵时间4 h,在充分供氧条件下,PDO产量仅为1.1 mmol/L;但在微量供氧条件下,PDO产量为16 mmol/L,是厌氧发酵时的1.28倍. 在微量供氧条件下,调控PDO合成的关键酶甘油脱氢酶、甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶的活性分别为7.28, 1.14, 0.52 U/mg,高于厌氧或充分供氧条件下的相应酶活性. 氧对细胞内NADH的合成也有影响,厌氧及微量供氧条件下菌体内NADH含量分别为3.78及3.72 μmol/g (DCW),高于充分供氧发酵时的0.85 μmol/g (DCW).     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

橡子粉同步液化糖化产燃料乙醇的发酵条件优化

以除去单宁的橡子粉为原料,应用活性干酵母同步液化糖化发酵(SLSF)制备燃料乙醇,并通过单因素试验和正交试验优化发酵条件。结果表明,同步液化糖化发酵技术适用于橡子粉发酵制备燃料乙醇;发酵的最佳条件为:除去单宁的橡子粉20 g,料液比为1:3(g:mL),淀粉酶100 U/g,糖化酶3 750 U/g,活性干酵母1.50%;在30 ℃静止发酵120 h,发酵液中的乙醇质量浓度达到106.5 g/L,橡子淀粉的乙醇转化率达到89.36 %。采用橡子粉发酵法制备燃料乙醇与以玉米等粮食作物为原料制备的燃料乙醇质量浓度相当,可以替代粮食作物生产燃料乙醇。     

重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌发酵工艺的优化

目的优化重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺,为其规模化生产奠定基础。方法以目的蛋白的表达量及菌体浓度作为综合评价指标,对重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的摇瓶发酵温度、初始pH值、溶解氧、IPTG浓度及诱导时间进行优化;以摇瓶发酵结果为基础,进一步对发酵罐培养工艺中诱导时机、诱导时间及补料培养基配方进行优化;以确定的罐发酵工艺条件连续发酵5批,验证该发酵工艺。结果最适摇瓶发酵工艺条件为:发酵温度为37℃,初始pH值为7.0,高溶氧,IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L,诱导时间为4 h;最适罐发酵工艺条件为:菌体A600值约为40时开始诱导,诱导时间为4 h,补料培养基配方为葡萄糖25%,MgSO4.7H2O 0.5%。按照确定的工艺连续发酵5批,最终菌体A600均达50.0以上,目的蛋白的表达量均高于15%。结论优化的重组戊型肝炎疫苗抗原工程菌的发酵工艺稳定性良好,已达到中试生产规模的要求。     

天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化

目的优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽。方法采用单因素试验和L(934)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响;用5 L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略。结果影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度>起始pH值>甲醇添加量>诱导时间,最佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5%、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH 7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12 h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平;高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白。结论优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础。     

短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基的优化

胸苷磷酸化酶在核苷类物质合成中具有重要作用,本研究以短乳杆菌为胸苷磷酸化酶生产菌种,对短乳杆菌产胸苷磷酸化酶发酵培养基进行优化。首先通过Plackett-Burman设计筛选出影响短乳杆菌产胸苷磷酸化酶的3个较为重要因素：发酵时间（P=0.030）、接种量（P=0.033）和葡萄糖浓度（P=0.019）。在此基础上采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域,并利用响应面中心组合设计对影响显著因素进行优化,得到最适培养基组成成分和培养条件为：发酵初始pH 8.0,葡萄糖18 g/L,酵母膏15 g/L,NaCl 7.5 g/L,蛋白胨10 g/L,胸苷15 mmol/L,摇床转速110 r/min,发酵温度38 ℃,发酵时间10.57 h,接种量1.54%。在此优化条件下,短乳杆菌产胸苷磷酸化酶能力得到了很大提高,短乳杆菌胸苷磷酸化酶活从0.400 U/mg湿菌体提高到1.172 U/mg湿菌体,比优化前提高了2.93倍。蛋白质凝胶电泳分析显示经优化后每克湿菌体胸苷磷酸化酶的含量明显高于优化前。