利用单个B细胞制备人源SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体

目的 利用单个B细胞制备人源严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)单克隆抗体，并检测其中和活性。方法 采集经2次SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)免疫，且抗体水平较高的人静脉血，用人外周血淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，经偶联S蛋白的磁珠分选表达S蛋白抗体的单个B细胞。将单个B细胞反转录后，用套式PCR法扩增IgG重链、轻链可变区基因；通过重叠PCR法将可变区基因与CMV启动子及IgG leader序列DNA片段、IgG恒定区及PolyA序列DNA片段连接，构建抗体线性表达盒。将同一B细胞的重链、轻链线性表达盒转染HEK293T细胞，表达人源SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫荧光法检测抗体免疫反应活性，假病毒中和试验检测抗体中和活性。结果 共表达了26株SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体，经Western blot检测，于相对分子质量约55 000和25 ...     

SARS-CoV-2 mRNA疫苗通用体外生物学活性检测方法的建立及验证

目的 建立通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的体外生物学活性检测方法,并对方法进行验证,以期用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。方法 筛选能够对SARS-CoV-2各变异株S蛋白均能较好结合的ELISA试剂盒及转染细胞、细胞铺板浓度、转染剂量,建立SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法,并进行验证。结果 筛选到1种对各变异株S蛋白均能良好结合的试剂盒,并确定了转染细胞为HEK293T、细胞铺板浓度为2.5×10⁵个/mL、转染剂量为6孔板4μg/孔,建立了通用稳定的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法。验证结果显示,该方法能满足检定需求。结论 建立的SARS-CoV-2 mRNA疫苗体外生物学活性检测方法相对准确度、线性、中间精密度、范围良好,可用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗的质量控制。     

表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域（receptor binding domain,RBD）和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法 将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×109copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果 重组腺病毒RBD和N基因能在H...     

重组SARS-CoV-2蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒的研制

目的 制备重组严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)蛋白疫苗抗原含量通用检测试剂盒，并进行验证。方法 选用中国食品药品检定研究院(简称中检院)制备的羊抗S蛋白多克隆抗体作为包被抗体，从4株单克隆抗体(14C8、15F9、17A7和20D8)中筛选出1株具有受体结合域(receptor-binding domain,RBD)结合活性高，且广谱抗主要突变株的单克隆抗体作为酶标抗体(用HRP标记)，制备重组SARS-CoV-2疫苗抗原含量的双抗体夹心ELISA法通用检测试剂盒，并采用棋盘滴定法对包被抗体稀释度(1∶125～1∶4 000)和酶标抗体稀释度(1∶250～1∶32 000)进行优化。验证试剂盒的专属性、线性范围、准确性、精密性及耐用性。将制备的通用检测试剂盒分发给12个实验室，检测各实验室自制的不同表达系统(CHO细胞、毕赤酵母、Sf9细胞或大肠埃希菌)和目的蛋白(RBD或S蛋白)的15批重组SARS-CoV-2蛋白疫苗原液(包括11批以WT株为参考序列设计的原液及4批以...     

基于柯萨奇病毒-A5复制子的SARS-CoV-2自扩增RNA疫苗的构建及其免疫原性评价

目的 构建基于柯萨奇病毒-A5(Coxsackievirus-A5,CV-A5)复制子的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株(B. 1.617.2)自扩增RNA(self-amplifying RNA,saRNA)疫苗，并评价其免疫原性。方法 以含有CV-A5全长基因组序列的质粒为基础，通过In-fusion克隆将SARS-CoV-2Delta突变株S蛋白基因替换不同长度的CV-A5 P1结构蛋白基因，分别构建重组质粒pDelta-S10、pDelta-S5和pDeltaS1(融合多聚蛋白的S-VP1/2A酶切位点上游的氨基酸分别为10、5和1个)。通过线性化重组质粒体外转录获得3种RNA分子Delta-S10、Delta-S5和Delta-S1。将3种RNA分子分别转染HEK-293T细胞，Western blot分析S蛋白的表达，筛选出S蛋白表达量最高的RNA分子，qPCR检测其在HEK-293T细胞中的自扩增。将筛选出的Delta-S用脂质纳米颗粒包装后，...     

SARS-CoV-2抗体标准物质的研制及应用进展

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)严重威胁人类健康和公共卫生安全。接种疫苗对有效控制疫情具有重要作用，全球已有150多个SARS-CoV-2疫苗进入临床试验阶段，38个批准紧急使用或上市。中和抗体水平是评价疫苗免疫原性的主要指标，但至今尚无标准化的SARS-CoV-2中和抗体检测方法，不同实验室和不同产品之间的中和抗体水平难以进行横向比较，严重制约疫苗和抗体类治疗药物的研发和评价。随着第一代SARS-CoV-2抗体标准品的快速售罄及SARS-CoV-2值得关注变异株(variants of concern,VOC)不断出现，2022年，WHO与我国同步开展了第二代标准品的研制工作。本文就WHO和我国SARS-CoV-2抗体标准物质的研制及应用进展作一综述。     

信号肽对SARS-CoV-2 S1、RBD、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响

目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响。方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组。通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库。将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×10⁶个/mL)和对数生长中期细胞(1.2×10⁷个/mL)。将各组病毒培养至100 mL(500 mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测。S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证。结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞,分...     

关于新型冠状病毒mRNA疫苗临床前药学研发和评价的思考

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)于2019年12月初在我国被发现,呈现出高传染性及快速传播的特点,并可导致一定比例患者出现重症新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。SARS-CoV-2是一种与重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)关系密切的新型人类冠状病毒[1-2],已在世界范围内传播并引发了全球性公共卫生危机。SARS-CoV-2引起的临床表现包括无症状感染、轻度流感样症状、肺炎、严重急性呼吸窘迫综合征甚至死亡[3-4]。     

湖北人群中ACE2蛋白与SARS-CoV-2互作位点的多态性分析

目的:研究湖北省健康人群血管紧张素转换酶2(Angiotensin Converting Enzyme 2,ACE2)与SARS-CoV-2互相作用位点处对应基因的单核苷酸多态性,以期揭示其与SARS-CoV-2易感性之间的联系.方法:选取湖北文理学院医学院临床专业学生16名,提取其口腔粘膜DNA,使用PCR技术检测本...     

HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。     

新型冠状病毒中和抗体的研发策略及研究进展

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)已形成全球大流行,对公共健康、社会经济等造成严重负担,迫切需要有效的控制手段。抗体在突发烈性传染病的预防及治疗中已具有良好的应用先例。目前全球有数百个SARS-CoV-2抗体研发项目正采用不同的策略开展研究,其中部分已进入临床。本文从靶标的选择、抗体的筛选技术、功能评价及可能面临的挑战四个方面,对目前SARS-CoV-2中和抗体的研发策略及研究进展作一综述。     

绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯对β淀粉样蛋白25-35诱导小鼠神经瘤母细胞N2a损伤的神经保护作用及其机制

目的探讨绿茶表没食子儿茶素没食子酸酯(green tea epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对β淀粉样蛋白25-35(beta-amyloid 25-35,Aβ_(25-35))诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a损伤的神经保护作用及其机制。方法体外培养N2a细胞,用含50μg/m L水溶性Aβ_(25-35)片段的DMEM培养液作用于N2a细胞后,加入不同浓度的EGCG(5、10、20、40μmol/L)作用不同时间(24、48、72 h),同时设模型组(未用EGCG处理)及DMSO组(仅用0.1%的DMSO处理)。MTT法检测EGCG对N2a细胞存活率的影响;JC-1法检测EGCG对线粒体膜电位的影响;半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测EGCG对N2a细胞中caspase-3活性的影响;Western blot法检测EGCG对N2a细胞内Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达水平的影响。结果与模型组和DMSO组比较,20和40μmol/L的EGCG作用24 h时,N2a细胞存活率及caspase-3酶活性明显降低(P0.05),A_(590)/A_(530)值显著升高(P0.05);20μmol/L的EGCG作用24 h时,N2a细胞中Bax和caspase-3蛋白表达水平均明显降低(P0.05),Bcl-2蛋白水平明显升高(P0.05)。结论 EGCG对Aβ_(25-35)诱导的N2a细胞的损伤具有保护作用,其机制可能与EGCG调控细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3的表达水平有关。     

抗新型冠状病毒抗体样本盘在其胶体金测试卡质量评价中的应用

目的建立抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗体样本盘,并应用于SARS-CoV-2抗体胶体金测试卡的质量评价。方法采用新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)康复者恢复期经病毒灭活的血浆样本建立SARS-CoV-2抗体样本盘,并进行优化。收集国内3个厂家(厂家S、厂家L、厂家H)胶体金测试卡,分别检测样本盘,并提出改进意见,厂家优化改进后,对优化后测试卡进行评价和比较。结果厂家S优化前测试卡的准确度为92.54%,灵敏度为90.78%,特异性为100.00%,约登指数为0.908,但阳性检测线颜色浅,不易辨识;优化后测试卡的灵敏度为95.35%,特异性为98.91%,准确度为97.19%,约登指数为0.943,且显色明显,易于判读。厂家L优化前测试卡检测IgM抗体的灵敏度仅为14.28%,漏检率较高,且显色不明显;优化后测试卡检测IgM抗体的的灵敏度达98.63%,显色明显且快速。厂家H测试卡检测IgG抗体的灵敏度为98.08%,特异性为100.00%,准确度为98.90%,约登指数为0.981;检测IgM抗体的灵敏度为84.50%,特异性为86.49%,准确度为85.71%,约登指数为0.710。结论本实验建立的SARS-CoV-2抗体样本盘可用于SARS-CoV-2抗体检测试剂的质量评价。     

SARS-CoV-2 δ变异株S抗原含量检测方法的建立及验证

目的 建立严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)δ变异株S抗原含量的检测方法，并进行验证。方法 采用δ变异株重组表达的受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白分别免疫山羊和家兔，制备抗RBD多克隆抗体。以制备的两种抗RBD多克隆抗体为包被抗体和一抗，HRP标记的羊抗兔IgG抗体为酶标抗体，建立用于检测S抗原含量的双抗体夹心ELISA法。棋盘滴定法确定包被抗体和一抗，同时优化3种抗体稀释度。验证方法的准确性、精密性、线性范围及专属性。采用建立的方法检测SARS-CoV-2 δ株灭活疫苗(Vero细胞)原液及其中间品的S抗原含量。结果 兔抗RBD多克隆抗体及羊抗RBD多克隆抗体的效价分别为1∶32 000和1∶64 000，蛋白浓度分别为2.26和5.41 mg/mL。最佳包被抗体为羊抗RBD多克隆抗体，一抗为兔抗RBD多克隆抗体，包被抗体、一抗及酶标抗体最佳稀释度分别为1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000。40、20、10 U/mL3种...     

用于新型冠状病毒快速诊断的荧光免疫层析试纸条的制备及其细胞成像

合成了双光子荧光标记探针LP并对其结构进行了表征,通过LP标记SARS-CoV-2的N-蛋白抗原(Ag)获得LP-Ag,并将LP-Ag制成免疫层析试纸条(TPICS)/试剂盒(TPICK).临床应用研究表明,与核酸法(PCR)/胶体金法比较,TPICS的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为98.99％/98.10％、99.55％/99.53％和99.38％/99.06％,其一致性系数Kappa值(K)为0.972/0.975,灵敏度、特异性和准确度分别为98.99％/98.10％、99.55％/99.53％和99.38％/99.06％.检测试剂与参比试剂检测结果一致(K>0.75),无统计学差异.TPICS/TPICK检测所用稀释血样一般为25～50μL(合全血样5～10μL),检测时间在10 min内,既避免了核酸法操作繁琐与检测周期过长的缺点,又克服了胶体金法因吸附官能团脱落而导致的不稳定性,具有良好的应用价值.LP-Ag可用于细胞中SARS-CoV-2 成像以鉴定其阴阳性.     

重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性。方法构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用。结果重组表达质粒pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用。结论已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础。     

SARS-CoV-2收获液滴度稳定性及灭活动力学分析

目的 对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)收获液在2～8℃环境下的滴度稳定性及β-丙内酯灭活剂对病毒的灭活效果进行研究。方法 将3批(批号：202111001、202111002和202111003)SARS-CoV-2收获液于2～8℃放置12 d，每隔3 d(0、3、6、9、12 d)取样，采用Karber法检测病毒滴度；2～8℃过夜平衡的3批病毒收获液按1∶4 000的体积分数加入β-丙内酯进行灭活，在不同的灭活时间点(0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、16、24 h)取样检测病毒滴度，取灭活8.0、16、24 h的病毒液进行灭活验证，取灭活24 h的病毒灭活液进行透射电镜观察。结果 2～8℃环境下，SARS-CoV-2的滴度随放置时间的延长不断降低，0～3 d滴度下降不明显，第12天滴度由最初的7.75、6和7.5 lgCCID₅₀/mL降至5.75、4.625和6.25 lgCCID₅₀/mL，表明2～8℃环境下病毒...     

基于奥司他韦衍生物的抗流感病毒H7N9的分子对接

研究奥司他韦类衍生物对新型禽流感病毒H7N9的抑制作用,本人选取32个奥司他韦类的合成化合物为配体,从PDB(Protein Data Bank)数据库中下载了H7N9的受体蛋白,因H7N9具有R292K-N9和R294K-N9两个突变型病毒,所以下载了包括4MWQ(N9-R294)、2QWE(R292K-N9)和4MWW(R294K-N9)三个神经氨酸酶的受体蛋白,将32个配体分子与3个受体蛋白分别进行分子对接,分子对接软件采用SYBYL-2.0中Surflex-Dock软件。结果发现,这32个奥司他韦类衍生物通过与4MWQ、2QWE、4MWW受体蛋白活性位点主要氨基酸残基主要产生氢键结合力、疏水作用和静电作用力而产生抑制作用,为新的神经氨酸酶抑制剂的研发设计提供了有用的结构信息,对流感病毒的新药研发具有积极的意义。